肺结核病患者单核细胞P糖蛋白、MRP表达与耐药关系分析

马清艳，刘晓飞，侯莉莉，丁 微，侯永华

(河北省胸科医院 1.结核四科；2.结核五科；3.内分泌科,河北 石家庄050041)

我国是结核病的高负担国家之一，耐药肺结核病人治疗极其困难，目前世界上仍缺乏敏感性药物[1]。然而耐多药肺结核病人的治疗周期长达18-24个月，严重者治疗周期达3年以上，且只有约一半的患者被治愈[2-3]，耐药肺结核已成为我国乃至世界各国结核病防治工作的难题。报道显示[4-5]，参与肺结核病耐药相关基因较多，而单核细胞P糖蛋白(Pgp)与多药耐药相关蛋白(MRP)等基因在耐药性中发挥重要影响。因此，本研究进一步探讨了Pgp、MRP在肺结核病中的表达情况，分析其与多药耐药的相关性,现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选自2019年1月-2020年10月于河北省胸科医院就诊的肺结核患者144例，其中耐药组92例，初治结核病组52例。男82例，女62例，年龄18-64岁，平均年龄(43.5±5.8)岁，病史1-8年，平均(3.7±1.1)年。同时健康体检者50例为对照组，男28例，女22例，年龄18-65岁，平均年龄(42.4±5.3)岁。纳入标准：①近8周内痰结核分枝杆菌培养呈阳性(耐药者药敏试验符合中华医学会结核病学分会制定的耐多药肺结核诊断标准)；②CT检查提示肺结核病灶。排除标准：①广泛耐药的肺结核病患者；③合并严重心、肝、肾功能异常者；④认知功能障碍、孕期或哺乳期女性。两组在性别、年龄等资料方面组间不具有统计学意义(P>0.05)，有可比性。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》中的相关要求，研究对象均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1试剂与仪器 反转录试剂盒(美国Promega公司)，Trizol试剂(美国Invitrogen公司)、Real-time PCR反转录试剂盒(上海耕欣生物科技有限公司)。PCR仪(ABI7500型)(美国ABI公司)，恒温磁力搅拌器(上海司乐仪器厂)，核酸蛋白测定仪(德国eppendorf公司)。

1.2.2提取样本RNA 收集研究对象空腹 8 h 的肘静脉血 6 ml 于 EDTA 抗凝管中。所有 EDTA 抗凝管收集的全血，采用Trizol法提取样本总RNA。以260 nm为波长，加入2 μl样品，采用核酸定量仪测定OD260和OD280，调整样品体积使得OD260和OD280比值在1.8-2.1之间。

1.2.3目的基因mRNA表达量检测 ①将RNA反转录为cDNA：将需要的RNA样品和反转录试剂混合均匀。于0.2 ml EP管中加入1 μg模板总RNA、1 μl rand promers、1μl oligo(dT)15 primers，补Nuclease-Free water至10 μl。将EP管置入PCR扩增仪中，70℃处理5 min，处理后再次将EP管置入PCR仪中进行25℃(5 min)、42℃(60 min)、70℃(15 min)反转录，获取产物cDNA。②cDNA扩增：以合成的cDNA为模板，按8Strip Caps进行基因扩增。将体系管置于PCR仪中，反应条件95℃预变性(10 min)、95℃(15 s)，60℃(1 min)为反应条件循环40次。采用ABI7500软件调整基线和阈值，每个上样孔设2个复孔，重复3次，读取ct值。目的基因相对表达量采用2-△△CT法分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 Pgp、MRP在肺结核病中的表达

Pgp、MRP在肺结核病组表达量及阳性率均高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.001)。见表1。

表1 Pgp、MRP在肺结核病中的表达

2.2 Pgp、MRP在肺结核病耐药组与初治结核病组中的表达

耐药组Pgp、MRP表达量及阳性率均高于初治结核病组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2、表3。

表2 Pgp在肺结核病两组中的表达

表3 MRP在肺结核病两组中的表达

2.3 耐药影响因素的单因素及多因素分析

单因素分析显示，耐药组与结核病组在年龄、性别、居住地、职业、是否有糖尿病及治疗时间比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。多因素分析显示，以患者耐药作为自变量，单因素及Pgp、MRP表达量作为因变量进行非条件Logistic 回归分析，结果显示年龄、居住地、Pgp、MRP表达量是肺结核病患者耐药的主要影响因素。见表5。

表4 耐药影响因素的单因素分析

表5 耐药影响因素的多因素分析

3 讨论

2018年WHO发布的全球结核病报告结果中，2017年全球新发结核病者1000万，耐利福平和耐多药者56万[6-7]。耐药结核病治疗周期长、花费大，且治愈率低、病亡率高。因此，耐药结核病的预防和控制已成为世界慢性病防治的关注重点。目前，耐药结核病的临床治疗主要通过患者用药史及药敏试验选择耐受性好、安全性高的二线药物或疗效不明确药物，未能达到满意的治疗效果[8]。经统计显示[9-10]，初治的结核病患者约50%-60%的患者多发生耐药，医疗花费大，导致患者负担增加，医疗资源浪费。因此，应强化对于肺结核病耐药机制的研究，提高治疗有效率，改善预后。

肺结核病耐药机制相对复杂，而Pgp和MRP是近年来受广泛关注的跨膜转运蛋白。MRP是位于细胞膜上的能量依赖的溢出泵，能够将进入肺部细胞内的多种药物泵出细胞外，导致多药耐药[11-13]。Pgp是由MRP编码产生，也位于细胞膜上的能量依赖溢出泵，同样可以把细胞内的药物泵出细胞外，使肺细胞耐药。本研究显示，Pgp、MRP在肺结核病组表达量及阳性率均高于对照组(P<0.05)。同时耐药组Pgp、MRP表达量及阳性率均高于初治结核病组(P<0.05)。表明Pgp、MRP可能参与了肺结核病及耐药性的发生。何飞歌等[4]报道显示，耐多药肺结核患者血清Pgp蛋白表达上调，而通过利奈唑胺治疗后，血清Pgp蛋白表达下降，这也说明血清Pgp蛋白与肺结核耐药相关。分析可能是由于血清Pgp蛋白表达阳性，可通过主动运输方式将亲脂疏水类抗菌药物转运至细胞外而发生耐药[14]。有研究表明[15]，Pgp 的表达水平与细胞耐药性呈正相关。MRP蛋白能够刺激细胞DNA调控因子或转录因子的激活，以及通过配体结合的信号通路机制，促进囊泡的释放，并增强囊泡包裹肺细胞内药物的能力，促进药物的排出。

在探讨不同的临床特征对肺结核病患者耐药的影响过程中初步发现，年龄、农村、Pgp、MRP表达量是影响多药耐药的危险因素，原因可能是，年龄大，机体抵抗力下降，可能与其易受到外源性感染有关。而农村患者更易发生耐药，可能与其防病意识弱，治疗不及时以及用药不规范等因素有关。而Pgp、MRP表达阳性是肺结核病患者耐药的独立危险因素。但由于本研究收集例数相对较少，上述各因素的相关影响仍需要进行更深入的研究。

综上所述，Pgp、MRP表达在肺结核病患者呈高表达，是肺结核患者耐药的独立影响因素。