T1期非肌层浸润性膀胱癌组织中FGFR3与CDKN2A的表达对预后的预测价值

薛亚明，于跃海，晋学飞，晋凡永

(吉林大学中日联谊医院 泌尿外科，吉林 长春130033)

膀胱尿路上皮癌(UCB)是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，约有60%-75%的初诊UCB为非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)[1]。对于这部分患者，通常应用经尿道膀胱电切术(TUR-B)序贯丝裂霉素C或卡介苗(BCG)膀胱灌注治疗[2]。虽然膀胱得以保留，但复发率较高，治疗后若复查不及时，可能复发并发展为肌肉浸润性膀胱癌[3]。筛选新的分子标志物，区分不同复发风险的T1期NMIBC患者是目前研究的热点。

成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)是UCB中最常见的发生过表达和突变的基因，约有40%的UCB患者携带FGFR3突变，其中近80%为低级别UCB[4]。目前研究发现，UCB早期即发生FGFR3突变，而FGFR3的过表达与其突变率增加有关[5]。细胞周期素依赖性激酶抑制剂2A(CDKN2A)是抑癌蛋白P16的编码基因，现有研究发现，当9号染色体9p区域发生杂合性缺失会造成CDKN2A表达缺失，Ploussard 等研究发现CDKN2A与FGFR3之间可能存在相互作用[6]。本研究目的在于观察FGFR3和CDKN2A在T1期NMIBC的表达情况，并分析其对预后的预测价值。

1 材料与方法

1.1 一般资料回顾性收集2014年至2016年，在吉林大学中日联谊医院泌尿外科行TUR-B治疗的NMIBC患者的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)肿瘤样本，并收集对应的临床和病理资料。纳入标准：(1)所有患者均为初诊；(2)T1期NMIBC；(3)所有患者在初次TUR-B治疗后6-8周，再次行TUR-B治疗。排除标准：(1)TUR-B治疗前接受过中医药治疗；(2)FFPE标本切片少于50%肿瘤细胞；(3)失访患者。病理分期和分级由两名正高级病理医师相互独立评价，评价依据美国癌症联合会(AJCC)2010年发布的第七版TNM分期和世界卫生组织(WHO)2016年发布的膀胱肿瘤分类。肿瘤无复发生存(RFS)定义为以病理学为诊断依据，未发生UBC(包括NMIBC和MIBC)；肿瘤无进展生存(PFS)定义为未发生MIBC或远处转移；肿瘤特异性生存(CSS)定义为因肿瘤原因死亡；总生存(OS)定义为因任何原因发生死亡。所有临床终点均以截至随访完成时。

1.2 mRNA表达的检测本次研究应用RT-qPCR方法检测mRNA的表达。应用AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit试剂盒(Catlog：80004，Qiagen，German)对FFPE标本进行RNA提取。所有操作均严格按照说明书进行。提取RNA后，用Nanodrop 2000进行定量并评价提取质量。应用TransScript○RGreen One-Step qRT-PCR SuperMix试剂盒(Catlog：AQ211-01，Transgen，China)对RNA进行逆转录，并进行RT-qPCR。本次研究除了检测FGFR3和CDKN2A mRNA表达水平之外，还检测基底亚型和管状亚型的标志物KRT5和KRT20，内参选用Calmodulin-2(CALM2)。各基因PCR引物序列如下：FGFR3，正义链：5’-CGTACTGTGCCACTTCAGTG-3’，反义链：5’-CCAGCAGCTTCTTGTCCATC-3’；CDKN2A，正义链：5’-GAGGGCTTCCTAGACACTCTG- 3’，反义链：5’-CGCAAATACCGCA-CGAC- 3’；KRT5：正义链：5’- CGGTAGTGGATTTGGTTTCG-3’，反义链：5’-TGGTGTTGCGGAGGTCAT-3’；KRT20：正义链：5’-GCAGTGGTACGAAACCAACG-3’，反义链：5’-CTGCAGCCAGCTTAGCATTG-3’；CALM-2：正义链：5’- CCACCATGGCTGATCAACTG-3’，反义链：5’-GCCATTGCCATCAGCGTCTA-3’。基因相对定量采用2-△△Ct法计算。

1.3 统计学方法应用Spearman相关性检验分析各基因mRNA表达的相关性；应用受试者工作曲线(ROC)中约登指数(Youden’s index)确定每个标志物的最佳分界值(Cut-off value)；应用Kaplan-Meier生存分析曲线进行预后分析；应用Cox多因素回归风险模型分析临床、病理因素与预后的关系。应用SPSS 25.0对结果进行分析，P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 队列信息根据纳入与排除标准，本次研究共纳入62例患者，其中男性42例，女性20例，中位年龄68岁，中位随访时间64个月，其中低级别1例(1.61%)，高级别61例(98.39%)，存在淋巴管侵犯1例(1.61%)，无淋巴管侵犯61例(98.39%)，原位癌(CIS)21例(33.87%)，序贯卡介苗膀胱灌注27例(43.55%)，序贯丝裂霉素C膀胱灌注11例(17.74%)。

2.2 FGFR3和CDKN2A mRNA表达与临床、病理参数的相关性Spearman非参数秩和检验结果显示，FGFR3与CDKN2A mRNA的表达无相关，与KRT5(rs=0.297，P=0.005)和KRT20 mRNA的表达均呈正相关(rs=0.314，P<0.001)；FGFR3高表达与肿瘤分级呈负相关(rs=-0.37，P<0.001)。CDKN2A与KRT5 mRNA的表达呈负相关(rs=-0.331，P=0.021)，而与KRT20 mRNA的表达无相关性。FGFR3和CDKN2A mRNA的表达与年龄、性别和序贯膀胱灌注治疗无相关性。

2.3 FGFR3和CDKN2A mRNA表达与临床结局的关系应用ROC曲线，通过约登指数确定对于不同的临床结局患者FGFR3和CDKN2A的最佳临界值，并据此将患者分为FGFR3(或CDKN2A)mRNA高表达组和低表达组。应用Kaplan-Meier分析两组患者不同临床结局的差异。结果发现，FGFR3 mRNA高表达组的患者具有更差的RFS，但PFS和OS有所提高，FGFR3 mRNA的表达与CSS无关，CDKN2A mRNA高表达组的患者具有更差的OS，而与RFS、PFS和CSS无关。见表1、表2。

表1 FGFR3表达情况与临床结局的关系

表2 CDKN2A表达情况与临床结局的关系

2.4 影响T1期NMIBC患者RFS和OS的单因素和多因素分析在单因素Cox回归分析中，高龄(≥70岁)、FGFR3高表达和CDKN2A高表达与复发风险增加显著相关；将这三个因素纳入多因素Cox回归分析中，高龄(≥70岁)和FGFR3高表达与复发风险增加显著相关。见表3。在单因素Cox回归分析中，FGFR3高表达与降低OS显著相关，鉴于FGFR3表达是OS唯一重要的预后标志物，因此没有对FGFR3进行多变量分析。见表4。

表3 影响T1期NMIBC患者RFS的单因素及多因素Cox回归分析

表4 影响T1期NMIBC患者OS的单因素Cox回归分析

3 讨论

FGFR3状态异常(过表达或突变)是UCB发生、发展的主要分子因素之一。目前研究结果认为，FGFR3状态异常可能是UCB早期的分子事件，且与UCB的分级和预后有关，但FGFR3与生存率的关系并不一致。van Rhijn等人研究发现，FGFR3突变的UCB患者RFS和CSS更长[7]，而Hernández等人则发现FGFR3突变可能会增加TaG1期UCB患者术后的复发率[4]。也有研究认为FGFR3与UCB预后无关[8]。Burger等人分析了221例NMIBC患者FGFR3的状态，发现存在FGFR3突变的患者，PFS更长，这一点在T1期高级别NMIBC患者中更为显著[9]。Sikic也得到了类似的研究结果，且对这部分患者进行了分层分析，发现这仅在年轻(<70岁)患者身上呈现相关性[10]。本研究结果也发现，FGFR3 mRNA高表达组的患者复发率更高，但PFS和OS有所提高。目前有几项研究发现，当FGFR3发生突变后，9号染色体9p区域会发生杂合子缺失，这会影响CDKN2A基因，并导致抑癌蛋白P16的表达降低，从而促进肿瘤进展[11]。Ploussard等人分析了58例NMIBC患者CDKN2A和FGFR3的状态，发现当9号染色体存在杂合性的患者中，FGFR3是否突变与预后无关，而对于9号染色体杂合性缺失的患者，FGFR3野生型的患者，其复发和疾病进展的风险会显著高于FGFR3突变型的患者[6]。Rebouissou等人发现，当FGFR3发生突变时，CDKN2A纯合子缺失的发生频率更高[11]。

CDKN2A的表达降低可能与UBC患者的不良预后有关。本次研究发现，CDKN2A mRNA高表达组的患者具有更差的OS，与目前大部分研究结果相似。Breyer等人研究发现当CDKN2A高表达的同时，FGFR3表达降低，这部分患者的PFS最差，对于T1期NMIBC患者，CDKN2A高表达仍是预后较差的预测因素之一[12]。CDKN2A作为一种抑癌基因，目前部分研究呈现出与其功能截然相反的结果，对于CDKN2A mRNA过表达为何会导致预后较差，目前尚不清楚。Lukas等研究认为，CDKN2A发生点突变对于UCB的发生、发展过程意义不大，但CDKN2A可以在抑癌因子RB1的上游发挥作用，其表达与TP53的表达有关，当RB1或TP53发生突变时，可能会减弱CDKN2A的抑癌作用[13]。在TCGA数据库中，约有50%的NMIBC患者存在TP53突变，13%的患者存在RB1突变，而Meeks等人的队列中，这两个基因的突变频率更高[14]。Al-Khalaf等人研究发现，CDKN2A可以上调与细胞增殖相关基因的表达，如成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)、细胞周期蛋白D1(CCND1)和E2F1转录因子1(E2F1)等。通过这种方式间接介导p16的表达[15]。然而，CDKN2A和FGFR3之间尚未显示出直接关系，这需要进一步研究。

本研究存在一定的局限性，首先是回顾性分析，且队列中患者数量较少，这限制了该研究的可重复性。其次，没有分析FGFR3和CDKN2A的联合表达，并进行分层分析，因为队列患者数量较少，包括组织学分级为低级别和存在淋巴管侵犯都仅有1例患者，进行更为细致的亚组分析可能得不到任何有意义的结论。此外，仅分析了FGFR3和CDKN2A的mRNA的表达情况，未应用免疫组化方法检测急性蛋白水平的观察，且未分析其突变状态，这些都需要后续改进。

综上，对于T1期NMIBC患者，FGFR3 mRNA高表达可能预示着较差的RFS，但OS更好。