肉苁蓉毛蕊花苷改善脑低灌注致小鼠认知功能障碍

2022-04-24刘恩宠马成俊王振华

烟台大学学报（自然科学与工程版） 2022年2期

刘恩宠,田原,韦瑶,马成俊,王振华

(烟台大学生命科学学院,线粒体与健康衰老研究中心,山东烟台 264005)

慢性脑低灌注(Chronic cerebral hypoperfusion,CCH)是指动脉硬化等多种原因引发的长期脑血流灌注不足,可致渐进性认知功能障碍,已成为老年人群高发脑血管病。CCH也可增加阿尔茨海默症痴呆风险,并参与了脑卒中所致的血管性痴呆进展[1-2]。目前CCH致认知功能障碍的确切机制仍未完全阐明,亦未有理想的临床干预措施。理想的CCH动物模型对于揭示其病理机制,筛选防治药物十分必要[3]。SHIBATA等[4]于2004年采用内径为0.18～0.22 mm的不锈钢微型弹簧,套于成年C57BL/6小鼠双侧颈总动脉,通过单次手术成功复制了双侧颈总动脉狭窄致CCH小鼠模型,已成为较为经典的CCH模型复制方法。

毛蕊花苷(Verbascoside,VB)是广泛存在于肉苁蓉、马先蒿等植物药资源中的苯乙醇苷类化合物[5]。已有研究发现,毛蕊花苷具有明确的抗氧化、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、神经保护、改善记忆障碍等广泛生理活性[6]。毛蕊花苷可以改善缺氧所致小鼠海马CA1区的神经元损伤以及海马体内的氧化胁迫状态[7],LI等也证实毛蕊花苷可改善模拟高原低氧所致海马CA1区神经元损伤及记忆功能损害,或与其调节脑组织氧化应激和mTOR信号通路有关[8]。

我国已于2018年将荒漠肉苁蓉(CistanchedeserticoLa Y. C. Ma)纳入药食同源目录,已有文献报道,自管花肉苁蓉制备的苁蓉总苷富含松果菊苷(44.3%),对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠短期内(7 d)的记忆缺陷有明确保护作用[9]。肉苁蓉中富含的毛蕊花苷是否可改善慢性脑低灌注所致认知功能损害,尚未见明确报道。本研究建立了不锈钢微弹簧致小鼠双侧颈总动脉狭窄致全脑低灌注模型,成功复制了CCH小鼠认知功能损害模型,考察了于饮水中添加毛蕊花苷提取物对小鼠认知功能障碍的改善作用,以期为基于肉苁蓉的相关功能食品开发提供可借鉴的思路。

1 材料

1.1 实验动物

健康雄性ICR小鼠,体重18～22 g,购自济南朋悦实验动物繁育有限公司,动物合格证号:SCXK(鲁)20140007。饲养于烟台大学实验动物中心,12 h昼夜明暗交替,室温23～25 ℃,相对湿度40%～60%,自由摄食饮水。小鼠饲以灭菌颗粒饲料和灭菌用纯净水。适应饲养一周,之后开始正式实验。

1.2 实验药品与试剂

新疆荒漠肉苁蓉由新疆凯美嘉生物科技有限公司提供,采收自新疆和田地区。参考文献方法[10]获得肉苁蓉苯乙醇苷类粗提取物,再按文献方法[11]经中压柱层析获得毛蕊花苷部位,HPLC鉴定提取部位含毛蕊花苷85.3%;水合氯醛(成都市科龙化工试剂厂);青霉素钠(山东鲁抗医药股份有限公司);非吸收性外科缝线4-0(扬州源康医疗器械有限公司);生理盐水(山东科伦药业有限公司);甲苯胺蓝O(北京拜尔迪生物技术有限公司);BSA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司);AChE测定试剂盒(南京建成生物工程研究所);SOD测定试剂盒(南京建成生物工程研究所);MDA测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。304不锈钢微型弹簧,购自永嘉县智翔五金有限公司,线径0.08 mm,外径0.35 mm,长度5.0 mm。

2 方法

2.1 微弹簧致双侧颈总动脉狭窄复制小鼠CCH模型

小鼠30只,禁食过夜后,按体重随机分为2组,每组15只。腹腔注射水合氯醛400 mg/kg麻醉后,仰卧位固定于37 ℃恒温手术台,碘伏和75%酒精消毒皮肤,沿小鼠颈部中线皮肤剪开一条2 cm的小口,钝性剥离结缔组织及颌下腺,分离两侧颈总动脉。解剖镜下将微弹簧绕颈总动脉旋转推进至套于血管外侧[4],两侧均套置成功后,缝合创口,同时腹腔注射5万单位青霉素钠,以防感染。小鼠置37 ℃恒温孵育箱待苏醒后,常规饲养,每笼3只动物。假手术组小鼠除两侧颈总动脉不套置微弹簧外,其他手术过程同CCH模型组小鼠。

2.2 模型验证

2.2.1 甲苯胺蓝O灌注染色考察脑低灌程度小鼠造模后24 h,水合氯醛麻醉,仰卧位固定于37 ℃恒温手术台,开胸暴露心脏,止血钳钳夹心尖部位固定心脏,剪开右心耳,自左心室灌注10 mL生理盐水,冲洗排除血管内血液,再于左心室缓慢灌注(30 s)5 mL 0.1%的甲苯胺蓝O生理盐水溶液,作为组织灌流指示剂,随即沿颅骨中缝打开颅骨,小心剥离全脑,生理盐水冲洗粘附血液,滤纸吸干水分,称重,置于小鼠脑切片模具(东莞市捷凯精工电子有限公司),冠状切成2 mm厚脑片,前切面向下顺序放置于培养皿中,于凝胶成像系统(上海天能5200Multi)反射可见光条件下拍照。另外,收集脑片,加入9倍量生理盐水,手持式电动组织匀浆器(德国IKA T10)匀浆,5000×g离心10 min,每样品取上清150 μL,加于96孔板,于540 nm检测波长下测定每孔光吸收,基于标准曲线计算单位脑质量甲苯胺蓝O含量,定量表征脑组织甲苯胺蓝灌注水平,以反映全脑灌注水平。

2.2.2 Morris水迷宫考察学习记忆微弹簧致小鼠CCH造模后4个月,Morris水迷宫考察小鼠认知功能。训练前两日,平台位于水面以上1 cm,第1天将小鼠置于水中平台停留30 s以熟悉训练环境,第2天将小鼠从4个象限分别放入迷宫,等小鼠寻找到平台,并在平台停留10 s,若在120 s之内仍未找到平台,则引导小鼠至平台并停留10 s;随后进行连续5 d的定位航行实验,将小鼠从每象限中点背靠迷宫壁放入水中,记录小鼠寻找至平台时间(逃避潜伏期),如果120 s内小鼠仍未找到平台,则引导此小鼠至平台停留15 s,将其逃避潜伏期记为120 s,每象限训练间隔时间30 s。在随后的空间探索实验中,撤掉平台,随机选定两个非目标象限,轮流将小鼠放于迷宫,记录小鼠于2 min内穿越原平台位置次数、不同象限停留时间及其游泳路程,计算小鼠在目标象限停留时间及游泳路程百分比,以表征小鼠长时程空间学习记忆情况。实验中平台位置及参照物保持不变,水温设定为25 ℃,小鼠训练结束后,吸水纸和毛巾擦干,原笼饲养。

2.3 肉苁蓉毛蕊花苷提取物对脑低灌注小鼠认知功能影响评价

本研究中,模型组小鼠造模70只,禁食过夜后随机选取12只作为假手术组,余58只按2.1方法复制小鼠CCH模型。造模组于第2日随机分为CCH模型组、毛蕊花苷提取物低、中、高剂量组,各组小鼠分笼饲养,每笼3只。考虑本研究所复制小鼠CCH模型于双侧颈总动脉套置不锈钢弹簧,长期灌胃抓握小鼠可能导致小鼠颈总动脉机械损伤,加之肉苁蓉已作为药食同源植物,安全性较高,且本研究旨在为肉苁蓉提取物作为功能饮品开发提供借鉴,因此研究采用于饮水中添加毛蕊花苷提取物方式给予小鼠,添加质量浓度分别为0.16、0.32和0.64 g/L,毛蕊花苷提取物溶解于无菌纯净水后,0.22 μm除菌滤膜过滤后使用,每日定时更换新鲜配制的毛蕊花苷提取物溶液。假手术组和CCH模型组给予无菌纯净水。于给予毛蕊花苷提取物4个月后,按“2.2.2”中的方法,Morris水迷宫测定各组小鼠空间学习记忆能力。

2.4 海马组织乙酰胆碱酯酶活力及氧化应激指标检测

行为学实验结束后,断颈处死小鼠,迅速取脑,分离两侧海马组织,精确称重后,加入9倍量生理盐水,冰浴条件匀浆,4 ℃下5000×g离心10 min,取上清液,按照试剂盒方法测定各组小鼠海马区乙酰胆碱酯酶(AChE)活力、超氧化物歧化酶(SOD)活力及丙二醛(MDA)水平。采用BCA蛋白定量试剂盒测定上清总蛋白浓度,进一步校准AChE、SOD活力和MDA水平。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 微弹簧致双侧颈总动脉狭窄成功复制小鼠全脑低灌注模型

为验证单次手术两侧颈总动脉套置微弹簧对小鼠脑灌注的影响,利用甲苯胺蓝O染液灌注后,观察脑组织染色情况,结果如图1所示。假手术组小鼠脑组织对甲苯胺蓝O均有明显着色,脑白质着色最深,CCH模型组小鼠全脑着色明显降低。图1中定量比色测定结果表明,CCH造模后24 h,脑灌注水平比假手术组降低了54.9%,表明采用微弹簧致双侧颈总动脉狭窄,可成功复制全脑低灌注模型。

图1 甲苯胺蓝O染色表示CCH模型小鼠脑组织灌流改变

为验证模型组小鼠是否产生认知功能障碍,利用Morris水迷宫实验检测小鼠的认知情况。小鼠定位航行过程逃避潜伏期的变化(图2(a))结果说明,随着训练天数增长,模型组小鼠未对水迷宫内标注物有所识别,未表现出学习功能,至训练第五天时,逃避潜伏期为73±47 s,与对照组(26±21 s)比较其差异具有统计学意义(P<0.01)。原平台位置的穿越次数(图2(b))、目标象限(原平台所在象限)的路程比(图2(c))以及时间比(图2d)三项指标,与对照组比较其差异均具有显著统计学意义(P<0.01)。以上结果说明,该慢性全脑低灌注方法可导致小鼠认知功能障碍。

图2 Morris水迷宫测定全脑低灌注致小鼠认知功能变化

3.2 毛蕊花苷改善慢性全脑低灌注所致小鼠认知障碍

为确定毛蕊花苷对小鼠认知障碍的影响,利用Morris水迷宫实验检测小鼠的认知功能。小鼠定位航行过程逃避潜伏期(图3(a))的结果说明,受毛蕊花苷干预的CCH小鼠对水迷宫内部标志物表现出良好的学习记忆能力,随着训练的进行可更快地寻找到救援平台。毛蕊花苷各剂量组均能显著缩短其逃避潜伏期时间(P<0.01),至训练第五天时,低中高剂量逃避潜伏期分别为50±21 s,44±16 s, 40±27 s,与模型组(83±37s)比较组间差异具有统计学意义(P<0.01)。撤去平台后,穿越平台次数结果(图3(b))表明,中高剂量组与模型组相比组间差异具有统计学意义(P<0.01),低剂量组没有统计学差异(P>0.05)。目标象限路程百分比(图3(c))和时间百分比(图3(d))两项指标均表明,各剂量组与模型组相比,组间差异均具有统计学意义(P<0.01)。与模型组相比,高剂量毛蕊花苷组可将路程比和时间比分别提高8.6%、8.3%。

3.3 毛蕊花苷下调慢性全脑低灌注所致小鼠脑乙酰胆碱酯酶活力升高

为进一步探究毛蕊花苷如何改善CCH模型小鼠认知功能障碍,通过检测小鼠脑部海马区AChE活力(图4),反映小鼠脑部神经冲动传导情况。CCH模型小鼠建成之后,与对照组相比小鼠脑部海马区AChE活力显著升高(P<0.01)。单因素方差分析的结果表明:毛蕊花苷各剂量组均能显著降低CCH小鼠AChE活力(P<0.01)，与模型组相比,高剂量毛蕊花苷组可降低 0.26 U/mg。

3.4 毛蕊花苷改善慢性全脑低灌注所致小鼠脑部氧化应激损伤

为探究毛蕊花苷能否改善小鼠脑部氧化应激损伤,对小鼠脑部海马区SOD活力、MDA的含量进行检测,结果分别如图5、图6所示。与假手术组相比,CCH模型小鼠脑部海马区的SOD活力明显降低(P<0.01),MDA含量明显升高(P<0.01)。单因素方差分析的结果表明:毛蕊花苷中高剂量可显著升高SOD活力(P<0.01),但是低剂量组的差异无统计学意义(P>0.05)。毛蕊花苷各剂量组均能显著降低MDA含量(P<0.01),高剂量毛蕊花苷组可使MDA 含量降低至模型组的82.5%。

图3 毛蕊花苷对全脑低灌注致小鼠认知功能损害的影响

图4 毛蕊花苷对慢性全脑低灌注小鼠海马区AChE活力的影响

图5 毛蕊花苷影响慢性全脑低灌注小鼠海马区SOD活力情况

图6 毛蕊花苷影响慢性全脑低灌注小鼠海马区MDA含量

4 讨论

肉苁蓉具有补肾阳,益精血,润肠通便之功效,已有苁蓉总苷胶囊用于血管性痴呆临床干预[12],但该制剂中主要含有松果菊苷和异毛蕊花糖苷,毛蕊花苷含量较低[13],尚不足以支持毛蕊花苷对血管性痴呆有明确干预作用。有研究表明毛蕊花苷对缺血性脑损伤有神经保护作用[14],但缺乏其对脑低灌注致认知功能障碍的确切作用证据。本研究于饮水中补充较低质量浓度(0.16～0.64 g/L)毛蕊花苷，明显改善了小鼠认知功能障碍。有研究表明毛蕊花苷具有良好的水溶性及稳定性[15],其来源植物肉苁蓉已为药食同源植物。本研究提示或可以毛蕊花苷作为关键指标成分,开发基于肉苁蓉的功能饮品,以改善老年人因脑供血不足而引发轻度认知功能障碍。

乙酰胆碱(ACh)是脑部神经冲动传导所必需的神经递质,AChE活力值升高必定会引发ACh的过度水解,引发脑部神经传导紊乱,参与诸多类型痴呆的发生[16]。本研究表明毛蕊花苷下调CCH模型小鼠海马组织AChE活性,或可改善脑内ACh水平,改善认知功能障碍,但仍待进一步研究确证。慢性脑低灌注致神经元损伤以及中枢胆碱功能障碍与慢性炎症及氧化应激损伤相关[17],此时过量生成活性氧可直接损伤各类生物大分子及不饱合脂肪酸,活性氧可灭活抗氧化酶进一步加剧氧化应激损伤,这一失代偿过程引发活性氧大量积累并诱导神经元凋亡,并致认知功能障碍发生。本研究发现CCH小鼠晚期海马组织SOD活性明显下降,MDA水平明显升高,提示海马组织抗氧化酶已处于失代偿的严重氧化应激状态。给予毛蕊花苷后,CCH小鼠海马组织SOD活力明显升高,MDA水平明显下降,表明毛蕊花苷一定程度上通过抗氧化作用发挥改善CCH小鼠认知功能障碍的作用。