基于网络药理学和分子对接分析桑菊饮治疗COVID-19的潜在机制

闫思超 杨春静 宝丽

1.首都医科大学附属北京世纪坛医院 北京 100038 2.临床合理用药评价北京市重点实验室3.临床合理用药生物特征谱学评价国际合作联合实验室

自2019年末起，由严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2（以下简称新冠病毒）引起的新型冠状病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）持续大范围流行，已在全世界造成极为严重的公共卫生问题。截至2021年9月22日，全球累计确诊COVID-19患者2.3亿例，累计死亡人数超过470万，然而在“封国”“封城”等严密措施的强硬管控之下，COVID-19疫情仍然未获得根本控制。为了研发疫苗和药物，各国投入了数以亿计的研发资金，以我国为例，2020年国家自然基金项目共立项343项，其中53%的科研经费用于与COVID-19相关的研究。为了有效治疗COVID-19、阻断疫情扩散，研发新的药物势在必行。

在缺乏特效药物的情况下，参照国家和省级诊疗方案，超过85%的国内患者接受了中医药治疗，统计数据证实中医药治疗疗效肯定，而且几乎已经成为目前改善临床症状的唯一选择[1-2]。中药新药有效成分和潜在靶点的分析[3]、单体化合物的分离提取、抗病毒的作用机制、多种复方的应用、并发症[4]及危重症[5]的治疗等，都是目前研究的重点和热点。

桑菊饮是中药传统复方，属辛凉解表之轻剂，源于清代温病学家吴鞠通[6]所著《温病条辨》卷一上焦篇，书中记载“此辛甘化风，辛凉微苦之方也。盖肺为清虚之脏，微苦则降，辛凉则平，立此方所以避辛温也”。该方自问世以来，一直是中医临床预防和治疗疫病常用的基础解表方剂。方中桑叶清透肺络之热，菊花清散上焦风热，桔梗、杏仁一升一降，清咽利膈、止咳化痰，连翘清热解毒，苇根（又名芦根）清热生津，甘草调和诸药，诸药配伍，共奏疏风清热、宣肺止咳之功效。凡风温袭肺、肺失清肃之风温初起，咳嗽、身热不甚、口微渴、苔薄白、脉浮数者，均可用之，现代临床常用于治疗感冒、急性支气管炎等属风热犯肺之轻证。2021年6月发布的《四川省新型冠状病毒肺炎中医药防控技术指南 （第六版）》中，桑菊饮被推荐用于COVID-19风热犯肺轻型；《湖南省新型冠状病毒感染的肺炎中医药诊疗方案（试行第三版）》中，桑菊饮被推荐用于COVID-19初热期温邪范肺型；广州中医药大学东莞医院专家团队拟定玉屏风散合桑菊饮加减作为COVID-19中药预防方。然而，桑菊饮治疗COVID-19的药效基础和作用机制研究仍处于起步阶段。

本项研究基于网络药理学方法绘制桑菊饮方剂的中药-成分-靶点相互作用模型，通过成分-靶点映射、基因本体（gene ontology，GO）和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析、蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）网络构建、中药成分吸收水平评价以及分子对接等方法，探索桑菊饮治疗COVID-19的可能作用机制，以期为后续基础实验研究以及临床实际应用提供参考数据。

1 对象和方法

1.1 桑菊饮有效化学成分及其映射靶点收集 利用中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP） （http://tcmspw.com/index.php）[7]，分别检索桑菊饮方剂中的8味中药“桑叶”“菊花”“桔梗”“苦杏仁”“芦根”“甘草”“连翘”和“薄荷”，参照口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和类药性（drug-likeness，DL）≥0.18的标准，遴选桑菊饮中的有效成分及其对应的靶点蛋白，构建桑菊饮的化学成分数据库。通过UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）[8]对靶点名称进行统一标准化处理，基于Cytoscape 3.8.2软件绘制“中药-成分-靶点”模型。

1.2 桑菊饮中化合物治疗COVID-19的映射靶点收集 在基因组注释数据平台（genome annotation database platform，GeneCard） （https://www.genecards.org/）[9]中，以“Corona Virus Disease 2019”为关键词，检索治疗COVID-19的作用靶点，以相关性评分为参考，进行降序排列。在桑菊饮化合物的映射靶点与COVID-19的作用靶点中取交集，并绘制韦恩图。

1.3 桑菊饮治疗COVID-19预测靶点的生物学功能和分子通路分析 利用DAVID 6.8数据库（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp）[10]， 将物种限定为“Homo sapiens”，对桑菊饮治疗COVID-19的交集靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，并分别绘制气泡图。

1.4 桑菊饮治疗COVID-19预测靶点PPI网络分析 基于STRING 11.5数据库（http://string-db.org）[11-12]，导入桑菊饮治疗COVID-19的预测靶点，限定物种为“Homo sapiens”， 设定最高置信度参数评分＞0.4，其余参数不变，构建桑菊饮治疗COVID-19预测靶点的PPI核心网络。

1.5 桑菊饮治疗COVID-19关键成分的吸收水平分析 基于中医药整合药理学研究平台（Integrative Pharmacology-based Research Platform of Traditional Chinese Medicine，TCMIP）V 2.0[13]，在中药成分数据库中，以桑菊饮关键化学成分的英文名称为关键词，搜索其吸收、分配、代谢、排泄和毒性（absorption，distribution，metabolism，excretion and toxicity，ADMET）水平，并结合OB及DL等重要参数对主要化学成分进行分析。

1.6 桑菊饮治疗COVID-19预测靶点的分子对接从桑菊饮治疗COVID-19作用靶点的PPI网络中，选取度值（Degree）排序前3位的核心蛋白受体及其对应的活性成分。通过结构生物信息学研究合作组织维护的蛋白质数据库（Research Collaboratory for Structural Bioinformatics protein data bank，RSCB PDB）（https://www.rcsb.org/）[14]下载相应靶点的蛋白结构，在PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）[15]中查询配体化合物的2D结构，并应用Chem Draw软件绘制相应的化学结构。

通过Pymol软件对靶点蛋白进行去水去氢，并处理对应配体；通过AutoDock Tools软件对受体靶点加极性氢，最后通过Python脚本和AutoDock Vina软件进行分子对接操作[16]，并计算受体和配体的结合能。结合能越低，代表亲和力越好，本项研究以结合能≤-5.0 kJ·mol-1作为筛选依据。

2 结果

2.1 桑菊饮中的化学成分及其映射靶点 根据筛选条件，收集到桑菊饮复方中桑叶的活性化合物29个，菊花活性化合物20个，苦杏仁活性化合物19个，连翘活性化合物23个，薄荷活性化合物10个，桔梗活性化合物7个，芦根活性化合物1个，甘草活性化合物92个。见表1。桑菊饮的8味中药，共含有201个活性化合物，其中32个活性化合物重复，映射去重后共获得该方的活性化合物共计169个，其中具有预测靶点的化合物共149个；预测靶点中重复靶点3 500个，映射去重后预测靶点共计308个。

表1 桑菊饮中药物活性化合物及预测靶点Tab.1 The active compounds and predicted targets in Sangjuyin

将交集中的活性化合物及靶点导入Cytoscape 3.8.2软件，构建药物-活性成分-靶点网络图，共包括485个节点（169个活性成分和308个靶点）和2 775条边。见图1。根据网络中的关键节点及其拓扑学参数分析，度值较高的活性化学成分分别为槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、木犀草素（luteolin）和汉黄芩素（wogonin），核心靶点主要有前列腺素G/H合成酶 2（prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2）、90kDa热休克蛋白αA1（heat shock protein 90kDa alpha A1，HSP90AA1）、雌激素受体α（estrogen receptor α， ESR1） 和钙调蛋白1 （calmodulin 1，CALM1）等。见表2。

表2 桑菊饮药物-活性成分-靶点网络的关键节点及其拓扑学性质Tab.2 Key nodes and topological properties of the Sangjuyin drug-active compound-target network

2.2 桑菊饮治疗COVID-19的作用靶点 在GeneCards数据库中，共检索到与治疗COVID-19相关的2 572个潜在靶点，将其与桑菊饮中化合物相对应的308个靶点互相映射并取交集后，共得到靶点99个。见图2。根据GeneCards数据库靶点相关性评分，列举交集中相关性评分前10位的靶点。见表3。

图2 COVID-19－桑菊饮相关靶点韦恩图Fig．2 Venn diagram of COVID-19-Sangjuyin related targets

表3 COVID-19-桑菊饮交集靶点中相关性评分前10位Tab.3 The top ten relevance score of overlapped targets in Sangjuyin and COVID-19

2.3 桑菊饮治疗COVID-9预测靶点的生物学功能和通路分析 利用DAVID数据库分析桑菊饮治疗COVID-19的预测靶点，以P＜0.05为条件，共收集到945个富集结果，其中包括479个生物过程（biological process，BP）、79个分子功能（molecular function，MF）、50个细胞组分（cell compound，CC）和126条KEGG通路。主要涉及对脂多糖的反应（response to lipopolysaccharide）、细胞对生物刺激的反应（cellular response to biotic stimulus）、对细菌来源分子的反应（response to molecule of bacterial origin） 和白细胞介素-17信号通路（interleukin-17 signaling pathway，IL-17 signaling pathway）、糖尿病并发症中的晚期糖基化终产物及其受体信号通路 （advanced glycation end products-receptor of advanced glycation end products signaling pathway，AGE-RAGE signaling pathway）、恰加斯病（Chagas disease）等。将排名前15的BP、MF、CC及KEGG通路绘制成气泡图。见图3。

图3 桑菊饮治疗新冠肺炎预测靶点的GO功能（A）和KEGG通路（B）富集分析Fig．3 GO function（A） and KEGG pathway（B） enrichment analysis of key targets of Sangjuyin for treating COVID-19

2.4 桑菊饮治疗COVID-19预测靶点的PPI分析 利用STRING 11.5数据库构建桑菊饮治疗COVID-19靶点之间的相互作用网络。见图4。分析度值、介数中心度（betweenness centrality）和邻接节点（neighborhood connectivity）等相关参数，设置筛选条件为以上3个拓扑结构的特征值均大于中位数，筛选出关键靶点12个，并按度值进行降序排列，主要包括信号转导与转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）、丝裂原活化蛋白激酶3（mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3）、 细胞间黏附分子1（intercellular adhesion molecule 1，ICAM1）和低氧诱导因子1α （hypoxia inducible factor 1 subunit α，HIF1A）等。见表4。

图4 桑菊饮治疗COVID－19预测靶点的PPI网络分析Fig.4 PPI analysis of targets of Sangiuyin for treating COVID－19

表4 桑菊饮治疗COVID-19蛋白质互作网络中的关键靶点Tab.4 The key targets in PPI analysis of Sangjuyin for treating COVID-19

2.5 桑菊饮治疗COVID-19关键成分的吸收水平分析 对桑菊饮治疗COVID-19中关键靶点（STAT3、IL-10和MAPK3等）映射的关键活性化合物进行ADMET分析。OB值越高代表药物化合物的DL越好，结果提示柚皮素（naringenin）、荷包牡丹碱（bicuculline）、汉黄芩素（wogonin）、桑心苏E（moracin E）、鸢尾甲黄素A（iristectorigenin A）和金合欢素（acacetin）吸收水平较好。见表5。

表5 桑菊饮治疗COVID-19关键成分的ADMET水平Tab.5 ADMET levels of core compounds in Sangjuyin for treating COVID-19

2.6 桑菊饮治疗COVID-19预测靶点的分子对接验证 利用Python脚本和AutoDock Vina软件，对桑菊饮中吸收水平最好的2个成分柚皮素和荷包牡丹碱及其对应的度值最高的核心靶点蛋白MAPK3、fos原癌基因蛋白（fos proto-oncogene，FOS）和HSP90AA1进行分子对接。见图5。化合物和靶点之间的结合能越低，代表两者结合的活性度越高。结果表明，2个活性化学成分分别与其对应的核心靶点蛋白受体对接，结合能均小于≤-5.0 kJ·mol-1，其中柚皮素与MAPK3的结合能为-6.9kJ·mol-1， 与HSP90AA1结合能为-7.6 kJ·mol-1；荷包牡丹碱与FOS结合能为 -10.0 kJ·mol-1，与HSP90AA1结合能为-7.0 kJ·mol-1，以上数据提示桑菊饮中的主要活性化合物和治疗COVID-19的关键靶点之间具备良好结合能力。

图5 痛泻要方治疗炎症相关结直肠癌主要活性成分及其核心靶点的分子对接分析Fig.5 The molecular docking diagram of the main active compound in TXYF and their core protein targets（left Overall， right detail）

3 讨论

自COVID-19疫情爆发以来，中西医结合治疗成为我国抗击疫情的特色和优势，国家卫生健康委连续出台了多个诊疗方案，其中中西医结合的治疗原则和方法被许多定点医院所采用，在阻止疾病向危重症发展的同时，也加快了患者的痊愈进程。刘安平等[17]应用加味桑菊饮治疗风热犯肺证COVID-19，发现西药联合加味桑菊饮能有效改善患者临床症状，缩小肺部感染范围，并能促使高敏C反应蛋白（high sensitive-C reactive protein，hs-CRP）水平及淋巴细胞计数趋向正常，临床疗效优于单纯西药治疗。

本研究共收集到桑菊饮中8味中药的活性化合物169个，以及对应的308个靶点信息。通过构建“药物-活性成分-靶点”网络，发现桑菊饮中每味药物都含有多种活性化学成分，每个活性化学成分又能够作用于多个靶点，构成了一个复杂的生物网络。其中，主要活性化学成分包括槲皮素、山奈酚、木犀草素、汉黄芩素和7-甲氧基2-甲基异黄酮等。槲皮素是一种黄酮醇类化合物，广泛存在于多种中草药中，具有抗糖尿病[18]、抗肿瘤[19]和抗高血压[20]等多种生物活性。研究表明，槲皮素与维生素C联合使用具有协同抗新冠病毒的作用，可用于高危人群的预防和COVID-19患者的治疗[21]。

利用GeneCards数据库检索与COVID-19相关的潜在治疗靶点，将其与桑菊饮对应的靶点互相映射，最终得到99个交集靶点，与COVID-19相关性较强的靶点包括IL-6、TNF、DPP4、IL-1β和EGFR等。 Meta分析结果提示，COVID-19患者的IL-6水平显著升高，并与不良临床结果相关，因此IL-6可能成为治疗COVID-19的潜在靶点[22]；在合并糖尿病的COVID-19患者中，使用DPP4抑制剂能够减少病毒进入气道，并能够阻断病毒复制，从而减轻肺部持续的细胞因子风暴和炎症[23]。

GO功能富集分析结果提示，桑菊饮治疗COVID-19与对脂多糖的反应、细胞对生物刺激的反应、对细菌来源分子的反应和氧化应激等BP明显相关。其中，在COVID-19危重患者中观察到的高水平中性粒细胞与活性氧自由基的过量表达有关，活性氧自由基诱发组织损伤、血栓形成和红细胞功能障碍，加重COVID-19病情[24]。

KEGG通路富集分析结果提示，桑菊饮治疗COVID-19与IL-17信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、恰加斯病（Chagas disease）和Th17细胞分化明显相关。研究表明，COVID-19患者的淋巴细胞会产生更多的TNF和IL-17，阻断IL-17可能成为治疗COVID-19的一种新策略[25]。

基于STRING数据库的PPI网络分析结果提示，桑菊饮治疗COVID-19的关键靶点主要包括STAT3、IL-10、MAPK3、ICAM1和HIF1A等。研究表明，新冠病毒成分能够诱导STAT1功能障碍和STAT3代偿性过度激活，建议将抑制STAT3纳入到COVID-19的治疗过程中[26]。通过分析血清样本中的炎症细胞因子和CRP表达特征，研究表明IL-10与COVID-19严重程度呈正相关关系，可用于病情恶化风险较高的患者的风险预测[27]。

基于TCMIP V2.0平台的ADMET分析结果提示，桑菊饮治疗COVID-19的主要活性成分中柚皮素（naringenin）、荷包牡丹碱（bicuculline）、汉黄芩素（wogonin）、桑心苏E（moracin E）、鸢尾甲黄素A（iristectorigenin A）和金合欢素（acacetin）吸收水平较好。研究表明，柚皮素在体外具有明显抑制新冠病毒的作用[28]。分子对接结果提示，桑菊饮中吸收水平好的活性成分与其对应的COVID-19核心靶点具有良好结合力。

综上所述，本研究运用网络药理学、分子对接等方法，对中医传统复方桑菊饮治疗COVID-19的可能核心靶点和机制进行了预测和分析，为进一步的实验验证工作提供了参考。针对桑菊饮在体内的具体作用机制，本课题组将在未来进行进一步实验验证。