荧光PCR检测非洲猪瘟病毒的经验探讨

2022-04-23韦洪才韦启行王显晋骆霞

云南畜牧兽医 2022年2期

韦洪才，韦启行，王显晋，骆霞

(望谟县农业农村局，贵州望谟 552300)

自非洲猪瘟疫情传入我国后，给我国生猪产业造成严重打击，县级兽医实验室作为基层实验室，在非洲猪瘟病毒检测中发挥着非常重要的作用。本文从样品采集、样品灭活及混匀处理、设备与试剂选择、核酸提取及PCR扩增、结果判读、非洲猪瘟检测关键技术等环节进行经验探讨，供基层兽医实验室同行参考，共同提高基层非洲猪瘟病毒荧光PCR检测能力。

1 样品采集

在对活猪进行非洲猪瘟病毒检测中，最常用的样品之一是猪抗凝血，本次试验检测猪抗凝血28份。猪抗凝血采集需要使用2～5mL规格的含有EDTA-K2抗凝剂的抗凝管(紫色盖帽)保存，采用前腔静脉采血法。

2 样品灭活及混匀处理

2.1 样品灭活处理

所有需要进行核酸检测的样品，检测前均需要放在60℃条件下灭活处理30min。

2.2 全血样品混匀处理

加样前将抗凝血样品颠倒混匀2～3次，使血细胞与血浆混匀。

3 设备与试剂选择

本实验室的荧光定量PCR仪(西安天隆公司GENTIER48E型号)、核酸提取仪(西安天隆公司NP968-C型号)；使用的试剂主要有两类：核酸提取试剂、荧光PCR检测试剂；使用西安天隆科技有限公司生产的病毒DNA/RNA提取试剂盒(4.0版)、青岛立见诊断技术发展中心生产的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒(2.0版)。

4 核酸提取及PCR扩增

4.1 核酸提取

采用核酸提取仪提取核酸，按核酸提取试剂盒说明书要求在设备上设置好提取程序。在反应板第1列和第7列分别加入20μL蛋白酶K溶液，再加入200μL样本。自动化程序结束后，对应的第6列和第12列即为提取的核酸样品。

4.2 PCR扩增体系

根据荧光PCR检测试剂盒说明书要求，根据检测样品数量在每个PCR反应管加入20μL PCR反应液；先取5μL阴性对照，再取5μL待检DNA，最后取5μL阳性对照分别加到不同的PCR反应管中，每次加样均需要更换移液器枪头。加样结束后盖紧反应管，每个反应管内液体的体积为25μL。

4.3 PCR反应条件

加样后将反应管瞬时离心，然后置于荧光PCR仪内，37℃孵育2min；95℃预变性20s; 95℃变性10s、60℃延伸30s，共40个循环；设置60℃时收集FAM和VIC/HEX荧光信号。

5 结果判读

5.1 单次试验的有效性

每次检测试验的阳性对照FAM和VIC/HEX通道均出现特异性扩增曲线且Ct值<35，阴性对照FAM和VIC/HEX通道均无特异性扩增曲线或无Ct值，则试验成立，否则试验不成立。

5.2 单管反应的有效性

每个样品反应管VIC/HEX通道Ct值≤37则该反应污染，该反应管检测结果不成立；当37

5.3 结果判定

结合FAM通道和VIC/HEX通道进行判定。见表1。

本次试验阳性对照FAM通道的Ct值为31.2，HEX通道的Ct值为30.7；阴性对照FAM通道和HEX通道均无Ct值，因此判定本次试验有效。每个待检样本的HEX通道均无Ct值，判定待检样本反应管检测成立，无污染情况，且每个待检样本FAM通道均无Ct值，因此判定本次试验28份待检样本全部为阴性。

表1 荧光PCR的结果判定

5.4 试验结果

共检测28份样品(单份检测)，样本设置及扩增曲线见图1。

图1 样本设置及扩增曲线

6 非洲猪瘟检测关键技术及经验探讨

6.1 样品采集

6.1.1活猪样品采集

活猪样品主要采集猪口腔液、猪抗凝血等。猪口腔液采集可用大号灭菌棉签放到猪口腔涂抹口腔液后，剪取棉球部分将其放入灭菌自封袋(或带螺旋盖帽的离心管)内，加入适量灭菌生理盐水后封袋(管)，并做好标记。猪抗凝血采集使用2～5mL规格的含有EDTA-K2抗凝剂的抗凝管，采血后及时颠倒混匀3～4次，使血液与抗凝剂充分混匀，否则易出现血液凝固现象。不可使用含肝素抗凝剂的抗凝管保存样品，因肝素会影响PCR的效率[1]。因全血样品中含有淋巴细胞，使用全血检测相比使用血清或血浆检测可提高检出率。

6.1.2死猪样品采集

可以在解剖后采集脾脏、淋巴结等病变明显的器官或组织，装入2mL的带有螺旋盖帽的灭菌离心管内。组织样品需要研磨处理(最好在组织研磨仪上处理，人工研磨容易污染)。

6.1.3环境样品采集

水样可用2～5mL规格的带螺旋盖帽的离心管盛装，样品量不超过管容量的四分之三。粪便、尘土等污染物采集可以用大号灭菌棉签浸湿灭菌生理盐水后再涂抹环境中的粪便、尘土等污染物，剪取棉球部分放入灭菌自封袋(或带螺旋盖帽的离心管)内，加入适量灭菌生理盐水后封袋(管)。

6.2 样品灭活处理

所有需要进行核酸检测的样品，检测前均需要在60℃条件灭活处理30min。样品灭活处理后再检测，可消除活病毒扩散出实验室的风险。

6.3 检测试剂选择

核酸提取试剂选择与核酸提取仪相匹配的，最好是同一厂家的核酸提取试剂或支持当前样品核酸提取的试剂(如：样品为全血时，核酸提取试剂盒说明书上要支持全血样品检测)；荧光PCR试剂选择有农业农村部批准文号的试剂。本实验室使用青岛立见诊断技术发展中心生产的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒(2.0版)，相比其他单通道检测试剂盒其优点如下：该试剂盒可FAM和VIC/HEX双通道检测，可以判断有无污染的情况，最大限度减少因污染造成假阳性结果的发生。

6.4 人员操作技术要求

6.4.1防止气溶胶污染

要认真按照试剂盒说明书或作业指导书步骤进行，防止试剂和样品受到气溶胶污染。操作时要戴一次性手套，若不小心溅上反应液，应立即更换手套。开离心管时要用双手，动作要轻缓，防止液体溅出[2]。

6.4.2移液器枪头的选择和更换

核酸检测全过程建议使用带过滤棉的枪头，每次试验需要重新加样或者对不同试剂做吸取时所用枪头要每次更换，以免对样品等造成污染[3]。

6.5 定期校准或检查主要设备

在试验中用到的主要仪器有荧光PCR 仪、冷冻离心机、生物安全柜、核酸提取仪、微量移液器等，要定期对这些仪器进行校准或功能性检查，确保仪器处于正常工作状态。要保持荧光PCR 仪的清洁卫生，避免仪器内部被荧光物质污染。试剂准备室和核酸提取室都要有一套完整移液器(量程覆盖0.2～1000μL)，不能互相调换使用[4]。