元江县山羊肠道寄生虫的感染状况调查与分析

董路，张誉方，蒙英雯，衡昭君，孙峰，周惠芬，李建昌，李晶，徐聪*

(1.云南农业大学动物医学院，云南 昆明 650201； 2.元江县动物疫病预防控制中心，云南 元江 653300；3.元江县红河街道农业农村综合服务中心，云南 元江 653300； 4.玉溪市动物疫病预防控制中心，云南 玉溪 653100)

近年来，随着养羊业的迅速发展，羊肠道寄生虫病的危害日趋严重，并成为影响养羊业健康发展的常见疾病之一。长期以来，羊肠道寄生虫感染较为普遍，虽然能在其粪样检查中发现虫卵，但大多为带虫者不表现明显的临床症状，从而极易被人们忽视[1]。肠道寄生虫在宿主体内掠夺宿主营养、造成宿主机械性损伤、毒素作用和免疫损伤以及继发性感染[2]，从而导致羊生长发育受阻，影响产品质量，甚至诱发其他传染病及人畜共患病等。羊肠道寄生虫病严重阻碍养羊业的发展，给养羊业造成了较大的经济损失。因此，有效控制羊寄生虫病的发生，促进养羊业的健康发展，对提高养羊业的生产效益和减少经济损失具有重要意义。

在云南，山羊感染的肠道寄生虫主要包括线虫、球虫、绦虫和吸虫，且有感染率高、感染强度大、分布广等特点[3，4]。赵阿普等[3]调查发现怒江州山羊寄生虫蠕虫感染率达到100%，线虫、吸虫和绦虫感染率分别为97.61%、78.57%和9.52%；泸西县山羊肠道寄生虫感染率为94.2%[5]；昆明市北郊山羊胃肠道寄生虫感染率为100%[6]；大理州部分地区总体感染率为82.4%[7]。元江县地处低纬度，属季风气候，空气湿度大，降水量多，这为动物肠道寄生虫病的定殖创造了良好的条件。目前，针对玉溪市元江县有关山羊肠道寄生虫病的报道较少。因此，为了解元江县部分地区山羊肠道寄生虫种类和感染情况，于2021年4—5月对元江县2个采样点6个不同养殖场采集的168份山羊粪样进行了肠道寄生虫感染情况的初步调查。本研究不仅为玉溪市山羊肠道寄生虫病的科学防控提供了数据支撑，也对进一步评估当地的公共卫生安全风险具有重要的兽医公共卫生意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1粪便样品采集

从元江县2个采样点6个不同养殖场共采集168份新鲜山羊粪便样品。将采集的粪便样品分别装入洁净的保鲜袋内，标明采样地、性别、年龄和编号等信息，4℃保存待检。

1.1.2主要器材

光学生物显微镜、10mL青霉素瓶、烧杯、60目筛网、载玻片、玻棒、铁架台、漏斗、麦克马斯特虫卵计数板、电子天平、离心机、漩涡振荡器、微波炉、恒温水浴锅、PCR仪、电泳仪、Eppendorf微量移液枪、凝胶成像系统、超纯水器等。

1.1.3主要试剂

饱和食盐水，粪便DNA提取试剂盒(美国OMEGA公司)，Gel Stain核酸染料(全式金)，6×Loading Buffer，DL2000Marker，Ex Taq DNA聚合酶(均购自TaKaRa公司)，50×TAE缓冲液(实验室配制)，琼脂粉(购自上海生工生物工程有限公司)等。

1.2 方法

1.2.1虫卵种类鉴定

采用饱和盐水漂浮法对粪便样品进行处理，在显微镜下观察卵囊或虫卵的形态结构、大小、颜色及卵壳和内容物等特征，并对照寄生虫标准图谱和相关参考文献[8]鉴别卵囊或虫卵的种类。

1.2.2感染强度测定

将显微镜下观察到的阳性样本用麦克马斯特(McMaster’s method)虫卵计数法测定每克粪便中的原虫卵囊数(Oocyst per gram，OPG)和线虫虫卵数(Eggs per gram，EPG)。分别测定粪便样品中球虫和线虫的感染强度。

1.2.3巢式PCR检测

严格按照OMEGA粪便DNA提取试剂盒(EZNAR stool DNA Kit试剂盒,型号：D4015-02)说明书提取粪样DNA。采用巢式PCR对168份样品分别基于毕氏肠微孢子虫的ITS基因和芽囊原虫、隐孢子虫的SSU rRNA基因进行检测。三种肠道原虫巢式PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，扩增条件按陶威等[9]和Karim等[10]的文献扩增。

1.2.4琼脂糖凝胶电泳和PCR产物测序

微孢子虫采用1.5%浓度的琼脂糖凝胶电泳，隐孢子虫和芽囊原虫均采用1%浓度的琼脂糖凝胶电泳，电泳条件均为110V、30min。电泳结束后在紫外凝胶成像系统中观察并拍照。将接近目的条带的PCR扩增阳性产物送至生工进行双向测序，测序结果进行NCBI-BLAST在线同源性比对，进而确定3种肠道原虫的种类。

1.2.5数据统计与分析

采用 SPSS 20.0统计软件对所得数据进行卡方检验(X2)，计算P值，比较不同采样点、年龄、性别因素间山羊肠道寄生虫感染率的差异。当P>0.05 时，统计学差异不显著；当P<0.05时，统计学差异显著；当P<0.01时，则统计学差异极显著。

2 结果

2.1 肠道寄生虫总体感染情况

本次对元江县168份山羊粪便样品肠道寄生虫检测的结果显示，元江县山羊肠道寄生虫总感染率为44.64%，以球虫和线虫感染为主(部分卵囊或虫卵形态如图1)；其中球虫感染率为44.64%(75/168)，线虫感染率为3.57%(6/168)，混合感染率为3.57%(6/168)；不同采样点间感染率差异极显著(P<0.01)。麦克马斯特氏虫卵计数结果显示，OPG值在0～23800，平均为883.33，EPG值在0～200，平均为7.14，见表1。

A：球虫卵囊；B：线虫虫卵；10×10。

表1 元江县部分地区山羊肠道寄生虫感染情况与感染强度

2.2 不同年龄、性别羊的肠道寄生虫感染情况

1岁以下山羊球虫感染率最低(6.55%)，1～2岁球虫感染率最高(22.62%)；2岁及以上山羊线虫感染率最低(0.60%)；不同年龄段间感染率差异不显著(P>0.05)。母山羊球虫感染率最高(29.76%)，公山羊感染率为14.78%；线虫感染率相同(1.79%)，不同性别间感染率差异不显著(P>0.05)，见表 2。

表2 不同年龄、性别肠道寄生虫感染情况

2.3 巢式PCR检测结果

采用巢氏PCR方法检测结果显示，168份粪样中有9份检测为阳性，总感染率为5.36%(9/168)，其中毕氏肠微孢子虫和芽囊原虫感染率分别为4.76%(8/168)和0.60%(1/168)，未检测到隐孢子虫感染，见表3。琼脂糖凝胶电泳结果显示，在250～2000bp出现两个单一且明显条带，与毕氏肠微孢子虫和芽囊原虫的目的片段392bp和1100bp大小相符，见图2。

表3 元江县部分地区山羊肠道寄生虫巢式PCR检测结果

M:DL 2000 DNA Marker；1—4:毕氏肠微孢子虫；6:芽囊原虫；5、7:阴性对照。

3 讨论

3.1 山羊肠道寄生虫感染情况

在四大群发病中(传染病、代谢病、中毒病、寄生虫病)，寄生虫病是一种慢发性疾病，且发病后大多不表现明显的临床症状，因此容易被人们忽视[11]。常见的肠道寄生虫主要包括线虫、球虫、绦虫和吸虫，感染后主要造成宿主腹泻、肠道阻塞、贫血、消瘦及皮肤过敏等症状[12]，从而严重阻碍羊的生长繁育，影响养羊业的发展。

本次调查结果显示，元江县部分山羊肠道寄生虫以线虫和球虫感染为主，总感染率为44.64%。其中，球虫感染率为44.64%，线虫感染率为3.57%，混合感染率为3.57%。OPG值最高为23800，平均为883.33；EPG值最高为200，平均为7.14。本调查结果均低于以下报道结果，但优势虫种与报道一致。朱丹等[13]、郑玲等[14]和曹树轩等[15]报道了我国部分地区山羊肠道寄生虫总感染率均在80%以上，优势感染虫种以球虫和线虫为主，感染强度和混合感染率显著高于本调查结果。同时，该结果也低于重庆[16]、江西[17]、乌鲁木齐[18]等地报道结果。分析其原因，一是可能与近年来元江县养羊产业加快养殖场地规模化、标准化建设，不断加大疫病防控力度和相关山羊寄生虫病的防治宣传有关；而球虫感染相对较为严重，这可能与放养羊群更易接触到外界环境中含有卵囊或幼虫的饲草和饮水有关。此外，该地区的养殖户大多为本地居民，未经专业养殖培训，对寄生虫的防控意识淡薄。二是可能散养户做过一些预防工作(如定期驱虫等)，虽然这些驱虫药物对蠕虫有一定的效果，但对球虫没有明显的效果。

3.2 不同采样点、年龄、性别肠道寄生虫感染情况

调查发现，a、b两地山羊球虫和线虫感染率分别为32.50%、2.50%和75.00%、6.25%，不同采样点间山羊感染率差异极显著(P<0.01)。从调查结果分析，这2种寄生虫在元江县山羊群体中均存在感染，究其原因可能是元江地处低纬度，温暖潮湿，为肠道寄生虫的体内外发育创造了有利的条件和机会。1岁以下山羊球虫感染率最低(6.55%)；1～2岁感染率最高(22.62%)；2岁及以上山羊线虫感染率最低(0.60%)；不同年龄段间感染率差异不显著(P>0.05)。有文献[19，20]报道，羊在不同年龄阶段消化道寄生虫感染程度有所不同，其原因可能是羔羊与外界环境接触较少，而成年羊主要以麦秸、青贮玉米等粗饲料为主，因此，增加了寄生虫感染的机会。调查结果显示，母山羊球虫感染率最高(29.76%)，公山羊感染率为14.88%，公、母山羊线虫感染率相同；不同性别间感染率差异不显著(P>0.05)，这可能与当地养殖场养殖环境和饲养管理有关。

3.3 山羊肠道原虫感染情况

此次调查结果显示，在168份山羊粪样中共检测出9份肠道原虫阳性，阳性率为5.36%，包括8份毕氏肠微孢子虫和1份芽囊原虫，阳性率分别为4.76%、0.60%，未检测出隐孢子虫感染。我国宁夏[21]、甘肃[22]地区的羊毕氏肠微孢子虫的感染率分别为14.48%和34.46%；甘肃[22]、安徽[23]地区羊隐孢子虫的感染率分别为4.52%和0.26%；据Li W C等[24]、谢世臣等[25]报道，我国部分地区和云南羊芽囊原虫感染率为0.3%、41.3%。国外，Udonsom R等[26]、Geurden T等[27]、Tan T C等[28]报道了山羊毕氏肠微孢子虫感染率为19.2%，隐孢子虫的感染率为9.5%，芽囊原虫感染率为30.9%。毕氏肠微孢子虫、芽囊原虫和隐孢子虫均为重要的人兽共患机会性和致病性肠道原虫[9]，3种肠道原虫呈世界性分布。本次调查的3种肠道原虫感染率均低于国内外的报道结果，究其原因，这3种肠道原虫感染率的差异，可能与饲养方式、不同品种、饲养卫生条件、采样季节、山羊年龄存在密切的关系。