miRNA-206及miRNA-26a在周围神经卡压后骨骼肌纤维化过程中的表达*

2022-04-23胡锐严立朱进李善庆安颖杨春宝王俊文

生物骨科材料与临床研究 2022年2期

胡锐严立朱进李善庆安颖杨春宝王俊文

周围神经慢性卡压损伤常致所支配的肌肉发生肌力减退、肌肉萎缩、肢体屈伸功能受限、特有的畸形等，严重影响患者肢体功能的恢复。在临床上，肘管综合征、腕管综合征等周围神经卡压损伤非常常见，早期通过外科手术，尽早解除神经压迫，可以起到很好的效果；但对于卡压时间长、程度重的患者，由于骨骼肌失神经支配后效应器发生了不可逆的退变，而神经再生缓慢，使得术后骨骼肌萎缩和纤维化无法恢复，故手术效果不甚理想。因此，探索骨骼肌失神经支配后发生肌萎缩及纤维化的发生机制，在神经长入前延缓骨骼肌萎缩及纤维化，是治疗周围神经卡压综合征的关键因素之一。

miRNA作为一类新的基因表达调控分子，在骨骼肌发生发育、肌细胞增殖分化等方面发挥着重要的调节作用，其中一些miRNA可能会成为骨骼肌萎缩诊断、治疗新的作用靶点。已观察到TGF-β/CTGF在骨骼肌纤维化病变中均有过度表达，而高表达的miRNA-206及miRNA-26a可降低TGF-β1、TGF-β2和CTGF受体的表达水平和胶原含量。本实验从2020年5月至2020年7月，采用Mackinnon等[1]建立的大鼠坐骨神经卡压模型的方法，模拟人体周围神经慢性卡压损伤病理过程，定期检测神经所支配骨骼肌组织内miRNA-206及miRNA-26a表达的变化及与TGF-β及COL-I含量的关系，探讨miRNA-206及miRNA-26a在失神经骨骼肌萎缩及纤维化过程中所起到的作用，从而为神经卡压后骨骼肌纤维化的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及材料

清洁级健康成年雄性SD大鼠50只，体重（200±15）g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，合格证号：SYXK（鄂）2019—0157；常规分笼饲养，自由饮水进食；单克隆兔抗鼠TGF-β及COL-I抗体购自英国Abcam公司。

1.2 实验方法

大鼠以戊巴比妥钠（40 mg/kg）做腹腔注射麻醉（见图1A）；无菌条件下，右下肢背侧部纵向切口，暴露股二头肌，经股间钝性分离，游离坐骨神经；采用Mackinnon所设计的坐骨神经慢性损伤模型，于梨状肌下缘约0.5 cm处，将消毒好的硅胶管（长10 mm，内径1 mm，外径2 mm）纵向切开一边，套住坐骨神经，然后用3条5-0尼龙线捆扎固定硅胶管，使硅胶管内径与神经直径相当，造成坐骨神经受到环形挤压（见图1B），作为手术组（实验组）。大鼠左侧大腿作为假手术组（对照组），只暴露坐骨神经，仅造成牵拉损伤（见图1C）。止血消毒后关闭伤口，常规方式饲养（见图1D）。分别于术后2、4、6、8、10周时间点，随机选取大鼠10只，麻醉下处死，取大鼠双侧后腿完整腓肠肌，备检。

图1 A.大鼠双后腿分别行假手术和神经卡压手术；B.实验组右后腿坐骨神经尼龙线捆绑硅胶管，造成卡压；C.对照组仅暴露左后腿坐骨神经；D.术后伤口缝合，常规饲养

1.3 观察指标

1.3.1 腓肠肌湿重比测定

将大鼠双侧腓肠肌自股骨内外髁起点至跟骨结节处完整取下，用电子天平准确称量腓肠肌湿重，计算实验组侧与对照组侧腓肠肌湿重的比值。然后将标本快速液氮冷冻保存于-80℃冰箱备检。

1.3.2 HE染色观察腓肠肌形态

大鼠腓肠肌固定时间24 h后，流水充分洗涤，将组织块修正为适当的大小，切取各组横切面标本，常规固定、脱水、浸蜡、包埋，5μm厚连续切片，HE染色后显微镜下观察腓肠肌肌纤维排列及测量截面积萎缩情况。

1.3.3 Masson三色法染色观察腓肠肌纤维化程度

大鼠腓肠肌石蜡切片4μm，脱蜡至水到蒸馏水；滴加Masson复合染色液染色5 min；蒸馏水冲掉染色；滴加磷钼酸染色5 min，甩干；滴加苯胺蓝染色5 min蒸馏水稍冲。滴加分化液分化30～60 s两次。显微镜下观察腓肠肌肌纤维与胶原纤维。

1.3.4 腓肠肌TGF-β及COL-I免疫组化分析

常规石蜡切片脱蜡、水化；PBS缓冲液洗涤切片后滴加3%H2O2；PBS缓冲液冲洗后滴加山羊血清封闭液；滴加兔抗TGF-β或COL-I抗体50μL，置于湿盒内，4℃过夜，滴加生物素化羊抗兔IgG，PBS洗后行DAB显色，自来水终止显色，苏木精复染，1%盐酸酒精分化脱水，透明，中性树胶封片后镜检。应用德国LEICA系统，在200倍视野下进行图像分析，用阳性反应细胞内的平均强度表示发生免疫反应阳性细胞内抗原物质量的多少。

1.3.5 实时荧光定量PCR（RT-PCR）技术检测miRNA-206及miRNA-26a及TGF-β、COL-ImRNA的表达

94℃预变性3 min，94℃变性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸30 s，共50个循环。应用SYBRGreen I荧光染料技术行实时定量PCR反应，获取各组标本的标准曲线，计算机分析Ct值，每个反应管内荧光强度达到系统认为的有目的DNA合成时的循环数（以阴性对照作参考）。

1.4 统计学方法

应用SPSS 20.0软件进行统计学分析。采用计算机图像分析仪，数据以均数±标准差表示，符合正态分布的两组计量资料比较时使用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 腓肠肌湿重比测定

于术后2、4、6、8、10周，将大鼠双侧后腿腓肠肌完整取下，发现实验组腓肠肌明显萎缩，色泽苍白，活性差；电子秤准确称取肌肉湿重，并计算大鼠右侧（实验组）腓肠肌湿重与左侧（对照组）腓肠肌湿重的比值，并计算各组内比值的均值，随着卡压时间延长，此均值逐渐减小，且两组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 腓肠肌HE染色形态变化及肌纤维截面萎缩情况

各取材时间点对照组大鼠腓肠肌肌丝肌节排列整齐，胞核明显，位于肌细胞中央。肌细胞间见丰富的毛细血管网及少量的成纤维细胞（见图2A）。实验组大鼠腓肠肌纤维随着卡压时间的不同而呈现不同的改变：2周时腓肠肌纤维横截面呈现肿胀样改变，成纤维细胞核仁增大（见图2B）；6周时可见肌纤维染色不均，横截面变细，肌细胞间隙变大，肌间隙纤维结缔组织增多（见图2C）；10周时可见肌纤维横截面明显变细，肌纤维轮廓模糊，肌丝肌节排列紊乱、崩解，肌束间成纤维细胞显著增多，结缔组织显著增多（见图2D）。

图2 腓肠肌HE染色（×200）：A.对照组；B.实验组2周时；C.实验组6周时；D.实验组10周时

对照组腓肠肌肌纤维直径相比，实验组术后各时间点肌纤维直径均小于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；实验组术后2、6、10周组肌纤维直径均值逐渐减小，组内比较差异有统计学意义（P＜0.05）。具体数据见表1。

表1 两组大鼠术后各时间点腓肠肌肌纤维直径比较（±s，n=50，μm）

注：*表示与实验组2周时直径比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；#表示实验组2、6、10周数据均值逐渐变小，且组内比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

组别对照组实验组t值P值2周29.15±1.34 27.39±0.94#2.351 0.013 1 4周25.85±1.29 23.37±0.99*3.622 0.001 9 6周26.05±1.09 23.81±0.95*#3.856 0.001 2 8周28.31±1.04 19.14±4.28*14.36＜0.001 10周23.80±0.97 18.86±1.20*#8.630＜0.001

2.3 Masson染色观察形态变化

胶原纤维呈蓝色，骨骼肌纤维呈红色，细胞核呈深蓝色。各取材时间点对照组腓肠肌肌纤维排列整齐，未见肌纤维萎缩，肌束间见少量胶原纤维包绕（见图3A）。实验组随着神经卡压的时间延长，见腓肠肌纤维逐渐萎缩变细，甚至轮廓模糊，肌纤维间的间隙逐渐增宽，增宽之肌纤维间隙间蓝色胶原纤维逐渐增多，且染色也逐渐加深。即随着神经卡压时间的延长，肌纤维所占截面积逐渐减少，胶原纤维所占截面积逐渐增大，原来肌纤维占据的空间大量被胶原纤维所代替（见图3B-D）。

图3 腓肠肌Masson染色（×200）：A.对照组；B.实验组2周时；C.实验组6周时；D.实验组10周时

2.4 免疫组化染色观察及图像分析

光镜下，阳性染色位于细胞浆膜，为黄色或棕黄色染色颗粒或片状分布于细胞内。对照组大鼠肌细胞的胞质TGF-β、COL-I的表达均呈阴性或弱阳性（见图4A、图4B）；实验组TGF-β及COL-I的表达随时间变化增强，且明显高于对照组（见图4C、4D）。计算机软件分析图片阳性染色强度见表2、表3，其吸光度值越大，表示阳性染色物质越多。两组不同时间TGF-β吸光度值比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图4 A.对照组8周时TGF-β阳性染色不明显（×200）；B.对照组8周时COL-I阳性染色不明显（×200）；C.实验组8周时见大量片状棕黄色TGF-β阳性染色（×200）；D.实验组8周时大量条索状棕黄色COL-I阳性染色（×200）

表2 两组术后不同时间TGF-β吸光度值测量比较（±s，n=50）

组别对照组实验组2周11.71±0.97 13.88±1.41 4周11.48±1.85 15.26±1.01 6周12.19±1.35 17.21±1.13 8周10.69±1.44 18.55±1.27 10周11.59±1.55 20.08±1.56 t值P值3.093 0.006 3 4.574 0.000 2 7.003＜0.001 10.04＜0.001 9.544＜0.001

表3 两组术后不同时间COL-I吸光度值测量比较（±s，n=50）

组别对照组实验组t值P值2周18.39±1.11 20.35±1.89 2.356 0.030 1 4周17.12±1.41 20.65±1.82 3.865 0.001 1 6周18.61±1.75 22.36±1.01 4.657 0.000 2 8周17.94±1.66 22.91±1.69 5.125＜0.001 10周17.68±1.81 24.13±1.36 7.059＜0.001

2.5 两组不同时间TGF-βmRNA、COL-ImRNA、miRNA-206、miRNA-26a的表达变化

以对照组TGF-βmRNA、COL-ImRNA，以及miRNA-206、miRNA-26a表达作为参考，实验组TGF-βmRNA及COL-I mRNA表达显著升高，且在神经卡压术后早期，其增加较快；miRNA-206及miRNA-26a表达均是先降低后升高，4周时表达最低，后表达逐渐升高。两组在不同时间TGF-βmRNA、COL-I mRNA，以及miRNA-206、miRNA-26a表达比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。具体数据见表4-7。

表4 两组不同时间TGF-βmRNA表达相对值（±s，n=50）

组别对照组实验组t值P值2周0.111 0±0.005 2 0.117 7±0.004 5 2.391 0.027 9 4周0.122 7±0.006 4 0.133 5±0.006 1 3.291 0.004 1 6周0.137 5±0.004 9 0.146 6±0.006 0 2.899 0.009 6 8周0.131 0±0.005 2 0.152 3±0.006 2 6.606＜0.001 10周0.127 4±0.007 4 0.170 4±0.008 8 9.685＜0.001

表5 两组不同时间COL-ImRNA表达相对值（±s，n=50）

组别对照组实验组t值P值2周14.81±0.71 15.91±0.84 2.489 0.022 8 4周14.65±1.18 16.52±1.15 2.964 0.008 3 6周15.21±1.12 17.24±0.97 3.648 0.001 8 8周15.15±1.13 17.49±1.16 3.575 0.002 2 10周14.80±1.29 18.64±1.04 5.898＜0.001

表6 两组不同时间miRNA-206表达相对值（±s，n=50）

注：实验组miRNA-206表达于4周时降至最低，后逐渐升高。

组别对照组实验组t值P值2周6.157 3±0.777 5 5.282 4±0.786 9 2.244 0.0377 4周7.234 6±0.570 7 3.661 0±1.786 8 11.1＜0.001 6周6.837 9±0.660 0 4.444 4±1.275 9 6.508＜0.001 8周6.705 0±0.707 2 5.564 0±0.797 5 3.153 0.0055 10周7.097 4±0.750 3 6.145 7±0.863 7 2.23 0.0387

表7 两组不同时间miRNA-26a表达相对值（±s，n=50）

注：实验组miRNA-26a表达于4周时降至最低，后逐渐升高。

组别对照组实验组t值P值2周2.251 8±0.270 9 1.805 9±0.250 9 3.106 0.006 1 4周2.087 0±0.339 3 1.220 9±0.178 3 5.332＜0.001 6周1.930 5±0.285 3 1.451 4±0.189 9 3.51 0.002 5 8周2.063 9±0.364 6 1.532 6±0.238 0 2.884 0.009 9 10周2.199 5±0.360 4 1.654 9±0.328 6 2.864 0.010 3

3 讨论

3.1 miRNA与失神经骨骼肌纤维化的关系

本研究通过大鼠坐骨神经慢性卡压模型研究神经支配腓肠肌的湿重、形态学变化及肌肉内各种纤维化因子表达的变化，了解到随着卡压时间的延长，随之发生骨骼肌肌节段损伤、肌原纤维降解、肌细胞线粒体破坏、肌管形成障碍、肌肉质量减轻等病变，最终会导致不可逆的肌肉功能障碍。本研究检测到miRNA-206及miRNA-26a在周围神经慢性卡压致骨骼肌纤维化过程中表达先下调，后上调，于4周时降至最低，后逐渐升高，表明miRNA-206及miRNA-26a在骨骼肌损伤和修复中起到一定作用。但是，miRNA-206及miRNA-26a在实验过程中并不是简单升高或降低，而是在不同时间出现波动性变化，可见miRNA对肌肉纤维化的调控有多因素参与并且是非常复杂的过程。miRNA-206及miRNA-26a可能有多个靶基因，或者其靶基因可能受多个miRNA的调控，这种复杂的网络式调节控制着骨骼肌各种纤维化因子的基因表达，是否还有其他重要的miRNA在肌肉纤维化过程中起到重要作用还需要更进一步的研究[2-3]。Mok等[4]研究显示，在骨骼肌组织中，存在特异性miRNA（miRNA-1、miRNA-206、miRNA-126、miRNA-26a等）参与了肌细胞的再生、分化、萎缩、功能发挥等各方面作用。Wang等[5]研究表明，miRNA-24、miRNA-26a、miRNA-181、miRNA-214、miRNA-1、miRNA-133、miRNA-206等可通过其靶基因YY1、HDAC4、IGE-1R、nPTB、Pola1、Cx43、Pax3、TGF-β、Pax7等对肌细胞增殖、分化、萎缩起到重要的调节作用。这些研究也同样证明了miRNA调控骨骼肌纤维化作用机制的复杂性。

3.2 miRNA-206与miRNA-26a在骨骼肌萎缩及纤维化过程中的作用

本研究结果显示，以假手术组做对照，卡压手术组腓肠肌TGF-β、COL-I均明显升高，TGF-β在卡压后持续高表达，miRNA-206及miRNA-26a表达也是先降低后升高，4周时表达最低，后持续升高，提示在一定浓度范围内，miRNA-206及miRNA-26a的表达量在骨骼肌纤维化病变中起到重要作用。研究表明，TGF-β长期过度表达能明显促进纤维化的发生发展，结缔组织生长因子（connectivetissuegrowth factor，CTGF）可介导TGF-β的促细胞外基质（extracellular matrix，ECM）聚集和组织纤维化效应[6-7]。COL-I是组织分布最为广泛的胶原蛋白，也是骨骼肌肌肉组织ECM的最主要组成部分，分析腓肠肌中COL-I的含量，能在一定程度上反映肌肉纤维化的情况。本研究通过对TGF-β、COL-I的检测，可间接了解肌肉纤维化程度。已有研究发现，TGF-β是miRNA-206和miRNA-26a的靶基因，在神经、肌肉等器官纤维化的过程中，miRNA-206和miRNA-26a直接作用于其mRNA的3'UTR，沉默TGF-β基因的表达，减少ECM的合成，抑制器官纤维化，证明miRNA-206和miRNA-26a通过下调TGF-β的表达，缓解器官纤维化[8-11]。本实验显示miRNA-206和miRNA-26a的表达在神经卡压损伤后迅速下调，但在损伤后的几周内又慢慢增加，可能是因为在骨骼肌的损伤与修复过程中，miRNA-206和miRNA-26a需要通过调节Smad-1和Smad-4来抑制TGF-β信号，而miRNA-206和miRNA-26a在肌肉内水平降低可抑制TGF-β信号，进一步促进肌原性分化，是肌肉正常再生所必需的[12-13]。因此笔者推测，miRNA-206和miRNA-26a可通过TGF-β信号通路调节骨骼肌萎缩及纤维化过程，同时其在骨骼肌失神经支配后肌纤维再生中也起到重要作用。

3.3 miRNA技术治疗失神经骨骼肌纤维化的展望

miRNA是细胞内源性小RNA，目前，人们将miRNA组装进入RNA诱导沉默复合物（RNA induced silencing complex，RISC）后，miRNA与靶基因配对而导致基因沉默，miRNA通过与目的mRNA结合，直接或间接调控着90%以上人类基因的表达[14-16]。已有研究表明，在敲除miRNA-206基因的小鼠模型中，骨骼肌运动神经元丧失、靶肌失神经支配、肌肉萎缩和纤维化情况明显加速，miRNA-206可部分通过组蛋白去乙酰化酶-4和成纤维细胞生长因子信号通路介导这些作用，它可认为是骨骼肌纤维化的一种良好的抑制剂[17]。目前，对周围神经卡压最有效的治疗手段为尽力早期解除卡压，使神经肌肉功能得以恢复。但由于周围卡压松解术后肌肉的萎缩及功能恢复还需要一段时间，由本研究也可以看到，在神经卡压4周后，miRNA-206和miRNA-26a持续高表达，而此过程骨骼肌的纤维化过程是持续进行的，同时伴随着肌纤维的再生与修复。笔者认为，在神经慢性卡压过程中，给予外源性miRNA-206和miRNA-26a可一定程度抑制TGF-β生物学效应，同时又可在肌纤维的修复与再生中起到一定正面作用，故即使不能及时行神经松解术，但早期对给予外源性miRNA-206和miRNA-26a对肌肉纤维化进行干预，对骨骼肌来说也是有益的。当然，这种作用有待进一步的研究。

综上所述，miRNA广泛存在于骨骼肌组织中，在骨骼肌萎缩及纤维化病变中上调或下调参与肌细胞的增殖、分化、凋亡等过程。研究miRNA在骨骼肌纤维化过程中的作用机制对预防骨骼肌萎缩及纤维化有重大意义。