缺氧诱导因子在骨肉瘤中的相关研究进展*

盛奇智 李广磊 刘平 阮锋 魏优秀

骨肉瘤（osteosarcoma）是临床上常见的恶性原发性骨肿瘤，好发于青少年或65岁以上老年人的长骨干骺端（以胫骨上端及股骨下端最多见），其转移早，恶性程度高，愈后差，特别是首诊即发现转移的患者的5年生存率不足20%。骨肉瘤组织细胞普遍存在缺氧的现象，缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factors，HIFs）作为缺氧条件下起重要调节作用的细胞因子，为处于缺氧环境下骨肉瘤细胞的存活、增殖和侵袭发挥了重要作用。本文就HIFs与骨肉瘤干细胞、HIFs与骨肉瘤的放疗抵抗、HIFs与骨肉瘤的多药耐药及HIFs抑制剂在骨肉瘤治疗的研究的相关进展进行阐述。

1 缺氧诱导因子的概述

现有的研究表明，在肿瘤细胞缺氧应答体系中，缺氧诱导因子（HIFs）居于核心调控位置。HIFs家族的3个成员HIF-1、HIF-2和HIF-3分别由α和β亚基组成，其中α亚基受细胞内氧气浓度精密调控，对HIFs功能的发挥起关键作用；在常氧条件下α亚基极易被脯氨酸羟化酶（prolyl hydroxylase domain proteins，PHDs）羟基化，然后与希佩尔林道病肿瘤抑制蛋白（vov-Hippel-Lindau tumor suppressor protein，pVHL）靶向结合，最后经泛素化—蛋白酶途径而被降解；在正常氧状态下，HIF-α的半衰期＜5 min。而缺氧条件时α亚基的羟基化作用被完全抑制，致使α亚基和β亚基发生异二聚化并转运进入细胞核，然后通过招募转录共激活因子p300/CBP，与靶基因的启动子上的缺氧反应元件（hypoxia responsive elements，HREs）相结合，调控多种缺氧反应基因。HIF-1α和HIF-2α在绝大多数正常组织中无表达，在多种肿瘤细胞中高表达[1]。HIF-1α通过诱导VEGF和糖酵解相关酶的表达，增加供血、供氧、供能，改善低氧状态[2]；通过诱导MMP-2、MMP-7和MMP-9表达上调从而促进恶性肿瘤转移[3-4]；通过诱导EMT相关蛋白SNAI1、TWIST、SLUG、Zeb1、SIP1、LOX、Vimentin、N-cadherin表达促进恶性肿瘤转移[5]。HIF-2α则通过表皮生长因子受体、胰岛素样生长因子受体和下游的细胞外信号调节激酶/苏氨酸激酶（ERK/Akt）等信号通路实现肿瘤增殖的调控作用[6]。Keith等[7]研究发现，HIF-1α和HIF-2α在疾病发展的不同阶段发挥作用，HIF-1α主要在早期肿瘤、急性炎症和缺氧中起作用，而HIF-2α在中晚期肿瘤阶段、慢性炎症和缺氧中作用更大。相对于HIF-1α和HIF-2α而言，人们对HIF-3α的认识和研究较为匮乏。目前学者普遍认为，HIF-3α可能在抑制HIF-1α和HIF-2α的功能中发挥作用，其功能有待深入研究[8]。

2 HIFS与骨肉瘤干细胞

有研究显示，缺氧诱导因子（HIFs）在骨肉瘤干细胞（osteosarcomastem cells，OSCs）中高表达，而选择性抑制HIF-1α或HIF-2α后发现干细胞增殖及迁移活性明显下降[9]。缺氧条件下，HIF-1和HIF-2能够通过激活相关信号通路（TGF-β、Notch、Hedgehog、Wnt/β-catenin等）调控骨肉瘤干细胞实现自我更新和侵袭迁移。转化因子β1（TGF-β1）是一种影响肿瘤细胞生长、侵袭、迁移的多功能蛋白质。缺氧条件下，HIF-1/2α通过激活TGF-β1基因转录表达可显著增强骨肉瘤干细胞（OSCs）的侵袭转移活性、干细胞成瘤性和瘤组织内新生血管生成能力[10]。有研究表明，TGF-β1的活性被抑制后，低氧诱导骨肉瘤去分化以及OSCs的自我更新受到明显抑制，这表明TGF-β1在维持OSCs的“干”性和多样性的作用十分重要[11]，进一步研究表明TGF-β1的作用还与干细胞基因Sox2、Nanog、Oct3/4的表达略微增加有关[10,12]。Wnt/β-catenin通路是骨肉瘤干细胞的一条经典的信号传导通路，在调控OSCs的自我更新、“干”性维持、侵袭转移等发挥作用[13]。低氧条件下HIF-1α与靶基因的HREs序列结合形成转录复合物，该复合物能促使磷酸化的β-catenin不被降解，致使β-catenin蓄积而进入细胞核启动下游基因的表达[14]。Liu等[15]用薯蓣皂苷抑制Wnt/β-catenin信号通路发现OSCs的“干”样表型活性及增殖侵袭能力下降。Notch蛋白是一种跨膜蛋白，被配体激活后，其胞内结构域（intracelluar domain of the Notch receptor，NICD）被释放入胞核，进而调控Hes及Hey蛋白家族[16]。Tohda等[17]研究发现，在低氧条件下，HIF-1α可激活Notch通路，进而促进肿瘤细胞增殖及侵袭。Notch信号通路的激活对骨肉瘤干细胞的维持及对骨肉瘤的演进起重要作用，同时Notch通路与骨肉瘤细胞侵袭转移表型以及乙醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）活性密切相关。Dai等[18]通过实验发现，用DAPT（一种新型γ-分泌酶抑制剂）靶向阻断Notch通路的活性后明显增加了OSCs的损耗，增强了顺铂对铂耐药骨肉瘤细胞的杀伤力。HIFs能诱导激活Hedgehog通路，促进骨肉瘤细胞侵袭和EMT的发生，调节和维持OSCs“干”性表型活性[19-20]。有研究发现骨肉瘤细胞中Hedgehog信号被异常激活，进一步研究发现成骨细胞的Hedgehog通路异常激活与骨肉瘤的发生密切相关，而抑制Hedgehog通路时OSCs的“干”性表型活力下降及骨肉瘤细胞增殖和转移受抑制[13,21-22]。HIF-3在骨肉瘤干细胞有表达，但其对骨肉瘤干细胞的作用研究并不多，作用机制尚不明确，HIFs在OSCs的研究多集中在HIF-1和HIF-2。

3 HIFs与骨肉瘤的放疗抵抗

传统认为骨肉瘤对放疗是不敏感的，DeLaney等[23]研究发现，组织病检已确诊患者给予低剂量分次放疗（2 Gy/次），总剂量达到或超过68 Gy，5年局部控制率仅40%。更高的辐射剂量有助于局部控制，但总体效果亦不是很明显。放疗主要破坏细胞DNA结构，一方面通过高能量直接使DNA双链断裂以及双螺旋的空间结构丧失，另一方面高能量辐射使细胞所在的内环境和细胞内产生大量活性氧自由基，使DNA双链氧化断裂。虽然细胞有完整高效的DNA修复系统，但不能保证所有的DNA损伤都能完整正确的修复，若不能修复或错误修复则导致细胞死亡或凋亡。骨肉瘤细胞生长迅速，现有的正常血管往往不能供给充足的营养和氧，虽然骨肉瘤组织会诱导新生血管，但由此产生的血管经常是结构和功能不完整的，因此骨肉瘤瘤体内部组织的细胞周围形成缺氧微环境。缺氧微环境下HIFs能使骨肉瘤细胞维持低代谢和低增殖水平，减少产生活性氧（ROS）以及减少DNA损伤，在缺氧环境下高代谢水平的骨肉瘤细胞发生死亡，但部分能耐受缺氧，在极低代谢水平下存活，这些“冬眠”细胞具有干细胞特性。这些“冬眠”的骨肉瘤干细胞的DNA复制基本“停滞”，放射线对其DNA损伤程度相对降低而导致放疗抵抗[23]。研究发现，HIF-1、HIF-2在骨肉瘤细胞表达水平与其放疗效果呈负相关性[24]。HIF-1α通过促进骨肉瘤血管形成、提高糖酵解水平等作用对逃脱电离辐射损伤的肿瘤细胞产生有利的作用。一般认为，HIF-2α在慢性缺氧过程中作用更持久[7]，据此推断HIF-2α对骨肉瘤的放疗抵抗起主要作用。Saint-Martin等[25]发现在相同放疗条件下敲去HIFs基因，细胞自噬和凋亡水平明显升高；敲去HIFs基因同时抑制细胞自噬细胞凋亡并无减少，而抑制HIF-2α活性后ROS含量显著上升使细胞大量死亡，说明缺氧条件下HIF-2α对细胞的放疗抵抗起重要作用。目前，HIF-2在骨肉瘤放疗抵抗的确切机制尚不清楚，HIF-3与骨肉瘤的放疗抵抗有无相关性亦未见相关报道。

4 HIFs与骨肉瘤的多药耐药

多药耐药（multidrug resistance，MDR）是骨肉瘤化疗面临的主要难题，也是决定骨肉瘤患者疗效的重要因素。近年来发现HIFs作为缺氧条件下调节细胞应答的主要细胞因子，与骨肉瘤化疗的多药耐药性密切相关。HIFs诱导的MDR主要是通过HIF-1α激活靶基因，启动MRP1/P-GP过表达。MRP1/P-GP几乎在所有机体细胞胞质都有表达，少量分布于细胞膜，是最早被认识的MRP（多药耐药相关蛋白）。MRP1/P-GP是一种包含2个ATP结合位点和12个跨膜结构域的膜转运蛋白，与胞内药物带正电或中性亚基结合，通过消耗2分子ATP耗能，将1分子药物排出至细胞膜外，泵出药物后使得细胞内药物作用靶点周围药物浓度降至药物起效阈值浓度以下，或者通过药物外泵使药物与作用靶点而产生多药耐药现象。缺氧条件下骨肉瘤细胞HIF-1α、MRP1/P-GP都上调表达，而人为抑制HIF-1α表达后MRP1/P-GP的表达明显受抑制，表明HIF-1α调控MRP1/P-GP基因的表达，HIF-1α与骨肉瘤细胞化疗多药耐药有关[26-27]。Comerford等[28]在分析上皮细胞及内皮细胞MRP1/P-GP缺氧下表达时发现在MDR1基因启动子－49－45序列上有HRE能与HIF-1α结合启动转录，这为研究HIF-1α骨肉瘤细胞的MRP1/P-GP表达提供了新思路。HIF-2/HIF-3对骨肉瘤多药耐药蛋白的调控的作用尚不明确。曾涛等[29]研究表明，骨肉瘤细胞MRP1/P-GP高表达与MDR密切相关，还能促进其侵袭转移。缺氧条件下，HIFs对骨肉瘤干细胞的促进作用在上文HIFs与骨肉瘤干细胞段落已阐述，骨肉瘤干细胞参与骨肉瘤多药耐药（MDR）也已被证实，但相关机制不明确。可能与下列因素相关：①骨肉瘤干细胞膜上高表达的ATPBinding Cassette蛋白，这类蛋白大多可运输并外排包括代谢产物、药物、毒性物质、内源性脂类物质、多肽、核苷酸及固醇类等多种物质，使之产生MDR。Tirino等[30]用免疫荧光显微镜观察发现ABCG2在OSCs表达明显高于骨肉瘤细胞，而且其外排泵的作用不被维拉帕米等药物抑制。②骨肉瘤干细胞能高效自我修复DNA双链。临床使用的铂类、烷化剂、拓扑异构酶制剂等抗肿瘤药物作用机制是破坏双链DNA结构，从而干扰细胞代谢导致细胞死亡，因此OSCs能高效修复DNA而对这几类药物耐药。研究发现，MLH1、MSH2等DNA修复基因在OSCs高表达[31]。田吉光[32]的研究发现，具有修复DNA作用的DNA-PK（DNA依赖蛋白激酶）在具有干细胞特性的骨肉瘤细胞MG63中有表达，而下调DNA-PKcs能提高骨肉瘤细胞MG63药物敏感性。③OSCs具备较强的自身解毒能力。ALDH（乙醛脱氢酶）是一种重要的细胞解毒酶，Gangemi等[33]研究表明在OSCs中ALDH的表达及活性都强于骨肉瘤细胞。④Bcl-2、IAP-1、IAP-2及survivin等抗凋亡蛋白在OSCs中上调明显，故OSCs的抗凋亡能力较骨肉瘤细胞明显增强。骨肉瘤中晚期多出现MDR，目前研究认为HIF-2α在中晚期肿瘤阶段、慢性炎症和缺氧中发挥作用更大，HIF-2与骨肉瘤的MDR有无相关性以及在其中发挥多大作用有待进一步研究发现。

5 HIFs抑制剂在骨肉瘤治疗中的研究

目前，有多种HIFs抑制剂用于骨肉瘤治疗的研究，其中有些药物已证实对骨肉瘤有效。目前已发现的HIFs抑制剂的作用机制有以下几种：①抑制HIF-αmRNA的转录或HIF-αs蛋白翻译合成；②影响HIF-αs的稳定性或HIF-αs与HIF-β的二聚化；③阻止HIFs与靶基因DNA的结合；④抑制HIFs转录复合物的形成。多柔比星是骨肉瘤常见化疗药，通过靶向抑制HIF-1与DNA的HRE序列结合阻止转录过程[34]。张斌等[35]研究表明，依维莫司通过抑制mTOR通路减少其下游感受器p70S6K而抑制HIF-1α的翻译，从而能增强阿霉素对骨肉瘤干细胞增殖侵袭抑制作用。EZN-2968是目前研究较多的人工合成的反义寡链脱氧核苷酸，它包含有16个和人HIF-1αmRNA完全配对的核苷酸残基，并以剂量依赖的方式下调人HIF-1α亚基表达，当浓度达5 mmol/L时即可完全抑制人HIF-1αmRNA的活性，试验表明：EZN-2968能下调肿瘤组织HIF-1α蛋白亚基的表达[36]，而EZN-2968仅有3个核苷酸残基能与人HIF-2α mRNA配对，故EZN-2968对HIF-2αmRNA的活性几乎无影响。目前EZN-2968正用于晚期肝癌的第三阶段I试验，将来有望用于骨肉瘤的治疗。姜黄素是从植物姜黄的茎和根中提取的活性色素成分，能发挥蛋白酶的活性降解HIF-1α到达下调肿瘤细胞HIF-1的作用，已证实对多种肿瘤细胞有抑制作用。李丁[37]通过研究姜黄素对骨肉瘤U-2OS细胞放疗敏感性的影响发现，姜黄素是通过抑制NF-κB通路减少ATM蛋白合成致使细胞的DNA自我修复能力下降来增强对放疗的敏感性。雌激素的代谢产物2-甲氧基雌二醇（2-ME）通过抑制HIF-1α和HIF-2α亚基的生成进而下调HIF-1和HIF-2，进而影响HIFs靶基因的转录活性。汤小燕等[38]通过动物实验发现，2-ME在小鼠体内能有效抑制骨肉瘤MG63细胞增殖并诱导凋亡，其机制与缺氧条件下2-ME下调HIF-1和HIF-2而抑制Bcl-2、VEGF、Caspase-3等基因转录有关，2-ME在动物体内未见明显毒副作用，有望成为治疗骨肉瘤的新型化疗药物。伏立诺他已证实能促进HIF-α降解但机制不明确，只是认为它作为一种组蛋白脱乙酰酶抑制发挥作用。Zhang等[39]通过研究伏立诺他联合顺铂对骨肉瘤U-2OS细胞的影响，发现伏立诺他联合顺铂通过JNK/caspase通路阻滞骨肉瘤细胞周期、诱导细胞凋亡来抑制骨肉瘤细胞增殖，该研究为骨肉瘤的化疗增敏提供了实验依据。目前在HIFs抑制剂治疗骨肉瘤的研究中多数是研究HIF-1抑制剂，少量是HIF-2抑制剂，对于中晚期骨肉瘤HIF抑制剂能否发挥理想的效果有待进一步研究。

6 小结

缺氧诱导因子（HIFs）能维持骨肉瘤干细胞的“干”性，促进骨肉瘤干细胞的侵袭转移，能增强骨肉瘤的放疗抵抗，增强骨肉瘤的多药耐药性，缺氧诱导因子抑制剂能抑制骨肉瘤的增殖及侵袭转移，从而达到治疗目的。目前，HIFs在骨肉瘤的研究多集中在HIF-1，对HIF-2的研究相对较少，而HIF-3的研究更是缺乏。深入研究骨肉瘤细胞中HIFs的相关调控机制，可为发现骨肉瘤治疗的新靶点和新方法提供思路，对研究骨肉瘤的复发、化疗药物的多重耐药、放疗抵抗及治疗骨肉瘤的新药研发都具有重大意义。