不同水解方式下蚕丝丝素蛋白材料的止血性能

雷彩虹， 俞林双， 朱海霖， 郑 涛， 陈建勇

(1. 浙江理工大学 纺织科学与工程学院(国际丝绸学院)， 浙江 杭州 310018； 2. 浙江省纤维材料和加工技术研究重点实验室， 浙江 杭州 310018)

利用止血材料进行止血处理是医疗救治的重要方法。长期以来，较为广泛使用的止血材料有无机沸石类、明胶类、氧化纤维素类、壳聚糖类等。尽管这些材料均显现出良好的止血效果，然而却存在有毒副作用、容易引起感染、成本及售价高等问题[1-2]。蚕丝是一种纯天然的动物蛋白质纤维，主要成分是丝素蛋白，具有可靠的生物安全性、良好的生物降解性、易加工成形等特性[3-4]，将蚕丝纤维应用于生物止血材料[5]的研究引起了人们的关注。

近年来，国内外研究者以蚕丝丝素蛋白作为原材料，通过不同制备方法获得各种蚕丝丝素蛋白止血材料，主要是分析某一种水解方式获得的蚕丝丝素蛋白材料的止血性能。如Chen等[6]采用 9.3 mol/L 溴化锂水解蚕丝丝素蛋白，研究丝素蛋白材料的体外止血活性；Huang等[7]基于氯化钙/乙醇/水(量比为1∶2∶8)水解蚕丝丝素蛋白，探讨改性丝素蛋白材料的止血性能。采用不同制备方法制得的蚕丝丝素蛋白材料具有不同的止血性能，但关于丝素蛋白水解方式与止血性能之间的相关性研究较少。

为此，本文采用氯化钙/乙醇/水溶液、碱性蛋白酶2种常用的水解方式水解蚕丝丝素蛋白，通过冷冻干燥法制备获得2种蚕丝丝素蛋白材料，采用凝血因子实验、血小板黏附实验、酶联免疫吸附实验、大鼠肝部出血实验等对其止血性能进行研究，以期为丝素蛋白止血材料的制备和应用提供参考。

1 实验部分

1.1 实验材料与仪器

材料：蚕茧(购自浙江省桐乡市)；无水氯化钙、无水乙醇、枸橼酸钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；硼酸盐缓冲溶液(上海康朗生物科技有限公司)；碱性蛋白酶(1.5×105U/mL，美国Sigma-Aldrich公司)；透析袋(截留分子质量为8 000 u)、维生素B12(1 300 u)、抑肽酶(2 500 u)、胰凝乳蛋白酶(25 000 u)、卵清蛋白(45 000 u)和牛血清蛋白(67 000 u)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；新西兰大白兔、健康雌雄不限成年SD大鼠，质量约为260 g(均由杭州师范大学实验动物中心提供)；云南白药(云南白药集团股份有限公司)。

仪器：CP214型电子天平(上海精天电子仪器有限公司)；超低温冰箱(上海比朗仪器有限公司)；Labconco FreeZone®4.5L真空冷冻干燥机(美国Labconco公司)；CA7000型全自动凝血分析仪(日本希森美康公司)；TEK8510型五分类血液分析仪(江西特康科技有限公司)；Victor X型酶标仪(美国Perkin-Elmer 公司)；Agilent 1100型高压液相色谱仪(美国Agilent Technologies 公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 蚕丝丝素蛋白材料的制备

脱胶蚕丝的制备：将一定量除去蚕蛹的蚕茧茧壳，加入至5 g/L碳酸钠溶液中，于98 ℃加热，重复脱胶2次(每次60 min)后清洗烘干，制得脱胶蚕丝。

盐解蚕丝丝素蛋白材料的制备：将上述制得的脱胶蚕丝按1∶10浴比溶于氯化钙/乙醇/水(量比为1∶2∶8)溶液中，于90 ℃反应3 h，冷却后将溶液抽滤，滤液灌入透析袋密封，经去离子水透析72 h后倒入聚苯乙烯培养皿中，于-80 ℃冷冻12 h，冷冻结束后再真空冷冻干燥72 h，得到盐解蚕丝丝素蛋白材料，标记为SF-A，真空袋保存备用。

酶解蚕丝丝素蛋白材料的制备：参考文献[8]称取一定量上述制备的盐解蚕丝丝素蛋白作为底物，设置底物的质量分数为5%，酶的用量按底物质量的2%添加，用0.5 mol/L pH值为8.5的硼酸盐缓冲溶液调节水解液的pH值为8.5，加入碱性蛋白酶在55 ℃反应2 h，反应后迅速升温至100 ℃将酶失活；然后将冷却后获得的溶液于15 000 r/min离心15 min， 用超滤膜(孔径为0.22 μm)过滤除去酶蛋白及沉淀物，再将滤液倒入聚苯乙烯培养皿中，于-80 ℃冷冻12 h，冷冻结束后真空冷冻干燥72 h，得到酶解蚕丝丝素蛋白材料，标记为SF-B，真空袋保存备用。

1.2.2 分子质量测试

参考文献[9]采用凝胶过滤色谱法，用高压液相色谱仪测试表征2种不同水解方式制备的蚕丝丝素蛋白的分子质量。测试条件：选取Protein KW-802.5型色谱柱；选用磷酸盐缓冲溶液(100 mmol/L， pH值为6.8)为洗脱液，洗脱速度为1.0 mL/min；进样量为10 μL；检测波长为215 nm。 用于拟合标准曲线的分子质量标准样品为：维生素B12、 抑肽酶、胰凝乳蛋白酶、卵清蛋白和牛血清蛋白。以保留时间(t)和分子质量的自然对数值(lnM)拟合得到标准曲线lnM=18.138-0.445t(R=0.997 8)，根据标准曲线计算蚕丝丝素蛋白的分子质量。

1.2.3 水溶性测试

称取一定量的干燥蚕丝丝素蛋白材料样品(m1， mg) 放入去离子水中，置于恒温磁力搅拌器上(30 min) 搅拌后过滤，烘至恒态质量，称量记为m2(mg)，每个试样测试6次取平均值。溶解率(W)计算公式为

W=(m1-m2)/m1×100%

1.2.4 凝血时间测试

在止血过程中，凝血因子的激活和血小板的黏附、活化对促进血液凝固有着重要的作用。采用活化部分凝血活酶时间(APTT)和凝血酶原时间(PT)考察蚕丝丝素蛋白材料对凝血因子的宏观影响。将抗凝兔血(血液与3.8%枸橼酸钠抗凝剂体积比为 9∶1) 离心(37 ℃、3 000 r/min)制备得到贫血小板血浆。按文献[10]将贫血小板血浆与0.05 mL氯化钙溶液(0.025 mol/L)和样品(1 mg/mL)混匀后，迅速采用全自动凝血分析仪测量此时的APTT和PT值，每个试样测试6次取平均值，未加入材料的空白组作为空白对照样。

1.2.5 血小板黏附测试

采用血小板黏附实验表征蚕丝丝素蛋白材料对血小板的黏附作用。将1.8 mL抗凝兔血与100 mg样品(云南白药为对照样品)充分混合，水浴恒温(37 ℃、 10 min)后离心(1 500 r/min、20 min)，采用五分类血液分析仪测试血小板数，每个试样测试 6次取平均值。 血小板黏附率计算公式为

N=(n1-n2)/n1×100%

式中：N为血小板黏附率，%；n1为空白组血小板数，个/mL；n2为加材料组血小板数，个/mL。做空白对照实验时不加任何物质，其他条件一致。

1.2.6 血小板第4因子测试

采用血小板第4因子(PF4)表征蚕丝丝素蛋白材料对血小板活化程度的影响。按文献[11]采用酶联免疫吸附实验测定，PF4含量用吸光度值的变化表征。将1.8 mL抗凝鼠血与0.2 mL 1 mg/mL样品(云南白药为对照样品)混合，于37 ℃恒温孵育15 min后，在3 000 r/min转速下离心10 min，取上清液为待测血浆。采用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度，每个试样测试6次，取平均值。

1.2.7 体内止血效果测试

通过大鼠肝部出血实验评价蚕丝丝素蛋白材料的止血效果。大鼠肝部出血实验参考文献[12]：将SD大鼠随机分成3组，每组6只。将麻醉后的SD大鼠沿腹中线剪一切口，使肝部中叶充分暴露，吸干肝脏周围组织液，在肝部中叶远端作1 cm的切口，血液涌出后立即将80 mg样品(云南白药为对照样品)贴敷于创口表面，观察并记录出血时间和出血量，每个试样测试6次，取平均值。

1.2.8 数据分析

2 结果与讨论

2.1 分子质量和水溶性分析

2种蚕丝丝素蛋白的分子质量根据标准曲线lnM=18.138-0.445t计算得到：由氯化钙/乙醇/水三元体系水解制备的蚕丝丝素蛋白的分子质量主要分布在4 700～20 700 u之间，由碱性蛋白酶水解制备的蚕丝丝素蛋白分子质量主要分布在400～10 400 u 之间，其中分子质量小于10 000 u的组分含量很高，且存在分子质量分布范围为400～5 000 u的低分子质量组分。水溶性测试结果表明，与盐解蚕丝丝素蛋白材料SF-A的水溶性((79.34±2.80)%)相比，酶解蚕丝丝素蛋白材料SF-B的水溶性(97.10±1.87)%)明显提高，这归因于利用碱性蛋白酶分解丝素蛋白时，能作用于较宽范围的肽键更大程度地促进了丝素水解，得到了水溶性较好的小分子丝素蛋白[8]。

2.2 凝血时间分析

图1示出2种水解方式制备的蚕丝丝素蛋白材料的APTT和PT值。与空白样相比，由不同水解方式获得的丝素蛋白材料SF-A和SF-B的APTT均显著缩短。从PT可知，2种蚕丝丝素蛋白材料的凝血时间相对于空白样均无显著性差异。表明其凝血作用与缩短APTT有关，与缩短PT无关。这也说明采用这2种水解方式制得的蚕丝丝素蛋白材料均能够通过激活凝血因子Ⅻ[13]，启动内源性凝血途径来促进血液凝固[14]。由图1还可见，酶解蚕丝丝素蛋白材料SF-B的APTT最短。由水溶性测试结果可知，SF-B的水溶性较好，更易通过液相激活促进凝血因子Ⅻ活化[15]。由此推测蚕丝丝素蛋白材料的APTT与水解方式有关，水解蚕丝丝素蛋白时采用碱性蛋白酶比氯化钙/乙醇/水三元盐水解体系更易缩短APTT。

图1 采用2种水解方式制备的蚕丝丝素蛋白 材料的APTT与PT值Fig.1 APTT and PT values for two different hydrolysis systems of silk fibroin materials

2.3 血小板黏附分析

由血小板黏附率实验测得2种蚕丝丝素蛋白材料SF-A、SF-B的黏附率分别为(24.85±5.68)%和(53.96±6.04)%。 可见，2种蚕丝丝素蛋白材料对血小板均有一定的黏附，均能诱导血小板黏附。其中，SF-B与对照样(黏附率为(44.21±3.13)%)相比，具有统计学上的显著性差异(P<0.01)。血小板黏附率测试结果还表明，采用2种水解方式获得的蚕丝丝素蛋白材料黏附血小板的能力不同，其中SF-B对血小板的黏附量高于SF-A，由此推测水溶性较好的酶解蚕丝丝素蛋白材料SF-B与血液接触时，有可能易形成较强的负电性表面，更好地促进诱导血小板黏附[11]，这需做进一步研究。

2.4 血小板第4因子分析

PF4是血小板在蛋白材料表面接触刺激下，被激活后合成释放到血液中的活性物质，能促进血栓的形成，是血小板活化的重要指标[16]。采用酶联免疫吸附实验测定时，吸光度值的变化与PF4含量呈正相关。图2示出采用2种水解方式制备的蚕丝丝素蛋白材料的吸光度。可以看出，采用2种水解方式制备的蚕丝丝素蛋白材料的吸光度不同，且明显比空白样高，进一步分析可知，2种蚕丝丝素蛋白材料均可促进PF4的生成，这意味着2种材料均对血小板具有活化作用，血小板激活后释放活性物质PF4，从而促进血小板血栓的形成达到凝血。从图2还可知，酶解蚕丝丝素蛋白材料SF-B使PF4的含量显著增加，说明酶解蚕丝丝素蛋白材料更能促进PF4的生成，对血小板有较强的激活作用，这与上述血小板黏附的讨论结果一致。综上可知，蚕丝丝素蛋白材料参与止血反应与诱导血小板的黏附和激活有关[7,17]。

图2 2种水解方式下制备的蚕丝丝素蛋白 材料的吸光度Fig.2 Absorbance value of silk fibroin materials produced by two different hydrolysis systems

2.5 体内止血效果分析

图3示出采用2种水解方式制备的蚕丝丝素蛋白材料肝部出血时间和出血量。可以看出，与空白样相比，当2种水解方式制备的蚕丝丝素蛋白材料作用于大鼠肝部创伤表面上时，出血时间迅速缩短，出血量显著减少。其中酶解蚕丝丝素蛋白材料SF-B的出血时间短，出血量少，优于云南白药对照样(P<0.01)，因此，具有较好的止血效果。综合前文分析推测，蚕丝丝素蛋白材料的止血性能与水解丝素蛋白方式有关，采用酶法比盐法更能提高其止血性能。

图3 2种水解方式下制备的蚕丝丝素蛋白 材料肝部出血时间和出血量Fig.3 Hemostatic time and amount of bleeding for silk fibroin materials produced by two different hydrolysis systems in liver trauma model

3 结 论

本文采用氯化钙/乙醇/水溶液盐解法和碱性蛋白酶酶解法水解蚕丝丝素蛋白，制得了2种蚕丝丝素蛋白材料，通过研究材料的分子质量、水溶性和止血效果，探究了水解方式对蚕丝丝素蛋白材料止血性能的影响，得出如下主要结论。

1)采用盐解和酶解2种不同水解方式制备的材料均通过激活凝血因子Ⅻ，启动引起血液凝固的内源性途径，并通过黏附、活化血小板促进血小板血栓的形成而止血。

2)凝血因子、血小板等指标与蚕丝丝素蛋白材料制备过程中的水解方式密切相关，采用碱性蛋白酶制备的丝素蛋白分子质量较低、水溶性较好，有利于激活凝血因子Ⅻ，更能对内源性凝血途径起促进作用，对血小板的黏附量增加，使血小板第4因子PF4的含量增加，止血性能增强。

3)用碱性蛋白酶水解蚕丝丝素蛋白制得的材料的出血时间短，出血量少，止血效果优于云南白药。