不同温度和饥饿胁迫下琥珀蚕AaHsp90 基因的表达特征

杨伟克，刘增虎，唐芬芬，胡昌雄，董占鹏

（1. 云南省农业科学院 蚕桑蜜蜂研究所，云南 蒙自 661101；2. 红河学院 生物科学与农学学院，云南 蒙自 661101）

热激蛋白（Heat shock proteins，Hsps）也叫热休克蛋白，广泛存在植物、动物和微生物体内。它是生物体在不利环境胁迫下产生的一种特定的应激性蛋白质，主要参与调控机体细胞内其他蛋白质的正确折叠和维持成熟蛋白质的生理活性[1‑2]。昆虫热激蛋白根据其相对分子质量、氨基酸序列和生物学功能，主要分为4 个家族：小分子热激蛋白（sHSPs）、Hsp60、Hsp70 和Hsp90[3‑4]。Hsp90 是昆虫机体内最丰富的应激蛋白之一，通过调控和维持细胞内多种蛋白质的构象及功能，使细胞在逆境胁迫下正常存活[5‑6]。温度是影响昆虫生长发育的主要因素之一，昆虫具有在非正常温度环境生存的能力，这是机体热激反应产生胁迫抗性的结果。Hsp90基因在昆虫体内会随着温度的改变而发生改变，它通过调控自身表达量增强机体对冷热胁迫的耐受性[7]。另外，Hsp90对维持昆虫正常生理代谢及生长发育具有重要作用。果蝇和赤拟谷盗Hsp83均属于Hsp90 蛋白家族成员，果蝇Hsp83基因对正常精子细胞的形成、存活和生长发育以及中心体正常发挥功能是必需的[8]。赤拟谷盗Hsp83基因在成虫卵巢发育过程起着重要的保护作用，通过RNAi 技术抑制赤拟谷盗Hsp83基因的表达，会导致雌虫无法产出成熟的卵细胞[9]。

琥珀蚕（Antheraea assamensis）是一种野生绢丝昆虫，主要分布在印度东北部和印缅边境地区[10]。因其茧丝坚韧、耐磨、呈天然琥珀色且不易褪色，具有较高的开发利用价值。在国内，云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所率先开展了野生琥珀蚕资源的调查搜集工作，并对其生物学特征进行了研究[11]。与家蚕相比，琥珀蚕具有典型的野蚕特性，能够更好适应野外恶劣的环境，然而其抗逆机制尚不清楚。Hsp90 作为昆虫机体一类重要的抗逆蛋白，在昆虫遭受各种不良胁迫、适应环境的过程中扮演了重要角色。目前，关于Hsp90 在琥珀蚕幼虫应对温度和饥饿胁迫过程中的生理作用及分子机制的研究鲜见报道。为此，探究琥珀蚕幼虫在遭受高温、低温和饥饿胁迫后热激蛋白AaHsp90基因的变化规律，不仅有助于深入了解琥珀蚕对外界恶劣环境的适应进化机制，还可为琥珀蚕的抗逆性研究和品种选育等提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

琥珀蚕来自云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所家蚕遗传育种与应用创新团队，幼虫在室内以新鲜天竺桂枝叶饲养至5龄第3天。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 主要仪器 恒温恒湿培养箱、低温冷藏柜和小型高速冷冻离心机购自上海一恒科学仪器有限公司；ABI 实时荧光定量PCR 仪、Bio-rad 普通PCR扩增仪和双光束紫外/可见分光光度计购自广州深华生物技术有限公司；琼脂糖凝胶电泳仪和凝胶成像系统购自昆明伯腾仪器有限公司。

1.2.2 主要试剂 高纯总RNA 快速提取试剂盒（货号RP1202）购自北京百泰克生物技术有限公司；PCR 扩增Mix（货号TSE101）购自北京擎科新业生物技术有限公司；反转录试剂（货号RR047A）和荧光定量PCR 试剂TB Green®Premix ExTaq™（货号RR42LR）均购自TakaRa公司。

1.3 方法

1.3.1 温度胁迫处理 选择体型大小相近的5 龄第3 天琥珀蚕幼虫，分别置于4 ℃低温和38 ℃高温条件下，并连续冲击1 h、3 h、6 h 和9 h，冰上解剖琥珀蚕幼虫，取血淋巴、脂肪体和中肠，对照组（26 ℃正常饲养）同时取材。每次取材均设3次重复，每个重复取3头蚕，样品用液氮速冻后置于-80 ℃保存备用。1.3.2 饥饿胁迫处理 从5 龄第3 天上午9 点开始停止喂食，在饥饿处理6 h、12 h、18 h 和24 h 后取材，取材方式同温度胁迫处理组。

1.3.3 总RNA 的提取和cDNA 的制备 根据高纯总RNA 快速提取试剂盒操作说明，提取琥珀蚕不同组织的总RNA。双光束紫外/可见分光光度计测定RNA 浓度，按照TaKaRa 公司反转录试剂盒操作制备cDNA，用于常规PCR 扩增和实时荧光定量PCR检测。

1.3.4 基因引物的设计和合成 以陈安利等[12]报道的琥珀蚕β-肌动蛋白基因（β-actin）（GenBank 登录号：KY676861）为内参基因，热激蛋白基因AaHsp90（GenBank 登录号：MK165664.1）为靶标基因。利用Primer Premier 5.0 设计定量引物，引物由生工生物（上海）股份有限公司合成（序列见表1）。

表1 实时荧光定量PCR引物Tab.1 Primers used in quantitative real-time PCR

1.3.5 靶标基因引物的PCR 检测 以反转录得到的cDNA 为模板进行PCR 扩增，扩增程序：98 ℃预变性2 min；98 ℃10 s，58 ℃10 s，72 ℃15 s，进行30个循环；最后72 ℃延伸5 min。采用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物，于凝胶成像系统中观察并拍照。

1.3.6 实时荧光定量PCR 检测 按照TB Green®Premix ExTaq™说明书配制荧光定量PCR 反应体系，根据Bio-Rad 公司CFX-96 实时荧光定量PCR仪操作说明设定运行程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃10 s，60 ℃30 s，循环40 次。采用2-△△Ct法计算基因的相对表达量[13]。利用Excel 2016和SPSS 21.0对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 琥珀蚕AaHsp90基因引物检测

以对照组琥珀蚕不同组织总RNA 反转录得到的cDNA 为模板进行普通PCR 扩增，其目的主要是明确AaHsp90基因定量引物的特异性以及是否有明显的引物二聚体产生。图1 结果显示，设计的AaHsp90基因定量引物能从cDNA 模板中扩增出目的条带，并且没有明显的引物二聚体条带出现。说明设计的引物符合荧光定量PCR 检测的要求，可用于后续试验。

图1 AaHsp90基因的PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification of AaHsp90

2.2 高温胁迫对琥珀蚕AaHsp90基因表达的影响

利用实时荧光定量PCR 技术对高温、低温和饥饿处理不同时间后琥珀蚕幼虫各组织AaHsp90基因的表达情况进行定量分析。将对照组AaHsp90基因的相对表达量设定为1，不同胁迫处理组AaHsp90基因的相对表达量若明显大于1，表明基因上调表达；若相对表达量的值明显小于1，说明该基因的表达受到抑制。

用38 ℃高温处理琥珀蚕5 龄第3 天幼虫，其中肠、脂肪体和血淋巴热激蛋白AaHsp90基因的相对表达量变化情况如图2 所示。高温处理1 h 和3 h，琥珀蚕中肠AaHsp90基因的相对表达量与对照组无差异；高温处理6 h，AaHsp90基因的表达明显上调，其相对表达量是对照组的1.71 倍；而高温处理9 h，AaHsp90基因的表达被抑制，相对表达量降至对照组的36%。高温处理3 h 和6 h，脂肪体AaHsp90基因持续上调表达，其相对表达量分别是对照组的2.92 倍和3.16 倍；高温处理9 h，脂肪体AaHsp90基因出现下调表达，表达量降至对照组的27%。血淋巴AaHsp90基因在高温处理1 h就开始上调表达，处理3 h 时，相对表达量最高，是对照组的4.75 倍；处理6 h 时，AaHsp90基因相对表达量有减弱的趋势，但仍高于对照组，其相对表达量是对照组的1.58倍；处理9 h 时，AaHsp90基因的相对表达量降至最低，仅为对照组的21%。

图2 不同时长38 ℃高温处理琥珀蚕不同组织AaHsp90基因的表达量变化Fig.2 Changes of AaHsp90 expression in different tissues of Antheraea assama after treatment under 38 ℃for diffferent time

2.3 低温胁迫对琥珀蚕AaHsp90基因表达的影响

图3 结果显示，用4 ℃低温处理琥珀蚕幼虫1 h，中肠AaHsp90基因的相对表达量略低于对照组；处理3 h 和6 h，AaHsp90基因的表达受到明显抑制，其相对表达量分别降低至对照组的38%和32%，9 h时相对表达量降至最低，为对照组的12%。低温处理1 h 和3 h，脂肪体AaHsp90基因的相对表达量与对照组无明显差异；处理6 h 和9 h，AaHsp90基因的相对表达量分别降低至对照组的21%和13%，基因的表达明显受到抑制。血淋巴AaHsp90基因在低温处理1 h 就开始下调表达，并随着处理时间的延长，持续下调表达；在低温处理9 h 时，相对表达量极低，仅为对照组的9.26%。

图3 不同时长4 ℃低温处理琥珀蚕不同组织AaHsp90基因的表达量变化Fig.3 Changes of AaHsp90 expression in different tissues of Antheraea assama after treatment under 4 ℃for diffferent time

2.4 饥饿胁迫对琥珀蚕AaHsp90基因表达的影响

由图4 可知，饥饿处理12 h 和18 h 均能明显诱导琥珀蚕幼虫中肠AaHsp90基因的表达，其中饥饿12 h，AaHsp90基因的相对表达量最高，是对照组的3.43 倍；而饥饿24 h，中肠AaHsp90基因的表达受到明显抑制，其相对表达量降至对照组的12%。饥饿6 h 对脂肪体和血淋巴AaHsp90基因的表达均没有影响。饥饿12 h 和18 h，脂肪体AaHsp90基因的表达量均明显高于对照组，相对表达量分别是对照组的2.91 倍和2.27 倍；饥饿24 h 对脂肪体AaHsp90基因的表达有明显抑制作用，其相对表达量降低至对照组的15%。血淋巴AaHsp90基因仅在饥饿12 h和18 h 出现微弱的上调表达，其相对表达量分别为对照组的1.46 倍和1.37 倍，饥饿24 h 严重抑制AaHsp90基因的表达。

图4 不同时长饥饿处理琥珀蚕不同组织AaHsp90基因的表达量变化Fig.4 Changes of AaHsp90 expression in different tissues of Antheraea assama after starvation for diffferent time

3 结论与讨论

昆虫在多变的自然环境中生存，会遭受多种外界环境的胁迫，比如饥饿的威胁、温度和湿度的骤变等。昆虫机体通过调控Hsp90基因的表达应对不良胁迫是其适应环境的一项重要策略[2‑3]。目前，许多昆虫的Hsp90基因被克隆鉴定，Hsp90基因能通过增强自身的表达量，抵御和应对不良胁迫[14‑18]。在高温36 ℃和低温4 ℃胁迫下，草地贪夜蛾雌雄成虫SfHsp90基因的表达量显著提高，表明Hsp90基因在响应环境温度胁迫，帮助昆虫适应外界条件变化过程中发挥了重要功能[14]。昆虫体内Hsp90基因的增量表达有助于其对温度的耐受性，用高温38 ℃和40 ℃胁迫处理瓜实蝇成虫1 h 和2 h 后，其体内BcHsp90基因的相对表达量均显著高于对照组[15]。梨小食心虫Hsp90基因的相对表达量在高温胁迫下随温度的升高而显著增高，且与温度胁迫程度呈正相关[16]。用40 ℃处理黏虫6 h，MsHsp90基因的相对表达量最高，说明MsHsp90基因在黏虫体内可以提高机体的耐热性[17]。柞蚕5龄幼虫经42 ℃高温处理30 min，血淋巴、中肠和脂肪体ApHsp90基因的表达量均显著高于对照组，表明ApHSP90基因在柞蚕抗高温中起到了一定的保护作用[18]。

琥珀蚕5 龄幼虫生长发育的最适宜温度是26～32 ℃，温度过高或过低均会抑制其正常的生理代谢进程，造成幼虫生长发育迟缓，甚至造成死亡[19]。本研究中，用38 ℃高温处理5龄第3天琥珀蚕幼虫，中肠、脂肪体和血淋AaHsp90基因的表达量均呈现先明显增加后急剧减弱的趋势。琥珀蚕幼虫血淋巴、脂肪体和中肠的AaHsp90基因分别在高温刺激1 h、3 h 和6 h 出现上调表达，说明不同组织AaHsp90基因对高温刺激响应的时间并不一致，而高温处理9 h，各组织AaHsp90基因的表达明显受到抑制。这表明短时间的高温刺激，能有效诱导AaHsp90基因的表达，提高琥珀蚕幼虫应对高温的耐热能力；而随着高温刺激时间的延长，AsHsp90基因的相对表达量急剧降低，琥珀蚕机体抵御高温的能力开始下降。4 ℃低温处理1 h，琥珀蚕中肠和血淋巴AaHsp90基因就出现下调表达，并且其相对表达量随着低温处理时间的延长逐渐降低。低温处理1 h和3 h，脂肪体AaHsp90基因的表达量无明显变化，当低温刺激时间增加到6 h 和9 h，AaHsp90基因的表达受到明显抑制，说明脂肪体AaHsp90基因对低温的响应晚于血淋巴和中肠。低温处理对琥珀蚕各组织AaHsp90基因表达有一定的抑制作用，表明琥珀蚕幼虫对低温的耐受性较弱。琥珀蚕主要分布在热带或亚热带地区，耐高温不耐低温是其长期适应环境的结果。

琥珀蚕未被完全驯化，具有典型的野蚕特性，在野外难免会遭遇一定程度的食物短缺，为了适应野外不断变化的环境，其自身耐受饥饿胁迫的能力也会有所提高。本研究结果显示，饥饿胁迫后，琥珀蚕中肠、脂肪体和血淋巴AaHsp90基因的表达量呈现先增加后急剧减弱的趋势。饥饿胁迫12 h 和18 h，琥珀蚕中肠、脂肪体和血淋巴AaHsp90基因的表达量均升高，其中饥饿12 h 各组织AaHsp90基因的表达量均最高，说明AaHsp90基因在琥珀蚕抵御饥饿胁迫时发挥了重要作用。但是饥饿24 h，各组织AaHsp90基因的表达量明显降低，表明琥珀蚕对饥饿的耐受是有限的。饥饿24 h 会导致琥珀蚕机体营养代谢水平减弱，在一定程度上抑制了AsHsp90基因的表达。

综上，琥珀蚕5 龄幼虫在遭受38 ℃高温或饥饿胁迫后，机体Aahsp90基因的表达量呈现先增加后急剧减弱的趋势，而4 ℃低温胁迫抑制Aahsp90基因的表达，这表明AaHsp90 蛋白在琥珀蚕幼虫抵御高温和饥饿胁迫的过程中发挥了一定的功能。