猪ANXA2 基因多态性及组织表达差异分析

卢 鸿，李新荻，王 宇，罗布白珍，段梦琪，叶幼荣，张 健，商 鹏

（1. 西藏农牧学院 动物科学学院，西藏 林芝 860000；2. 西藏特色农牧资源研发省部共建协同创新中心，西藏林芝 860000；3. 林芝市巴宜区畜牧兽医总站，西藏 林芝 860000）

随着对食品健康营养安全的重视，人们对肉品质的要求越来越高，脂肪组织是影响猪肉品质的一大因素[1]，直接影响猪生产的经济效益[2]。因此，对猪脂肪组织的生长发育及代谢调控研究具有重要意义。

膜联蛋白是一种与Ca2+和脂质结合密切相关的蛋白质家族[3]，存在于细胞内和细胞外的不同位置[4]，与多种膜脂质和蛋白质相互作用，参与钙离子通道形成、细胞生长、细胞增殖、细胞分化等细胞生理活动[5‑6]。膜联蛋白家族由12 个进化保守且结构相关的Ca2+和磷脂结合蛋白组成，所有的膜联蛋白都具有一个高度保守的中心结构域，可以通过Ca2+介导的方式与细胞磷脂可逆的结合[7]。膜联蛋白A2（Annexin A2，ANXA2）属于膜联蛋白（Annexins）家族A 亚家族的成员之一，包含一个中央域和一个N端中央域，其中包含与钙离子、磷脂等其他物质的结合位点[8‑11]。近年来，ANXA2基因对脂肪影响方面的研究逐渐凸显。付睿倚[12]利用蛋白质组学技术研究北京油鸡肌肉发育和肌内脂肪沉积的分子机制，发现ANXA2基因是调控脂类代谢的关键基因；周扬[13]利用二代高通量测序技术分别对胎牛、成年公牛、成年母牛和成年阉牛皮下脂肪组织进行转录组测序分析发现，ANXA2基因在脂肪组织内表达量较高。此外，ANXA2基因还在人类和啮鼠的脂肪组织中表达[14‑16]。另有研究表明，在猪的输卵管中，ANXA2基因与精子结合有关[17]；ANXA2蛋白与猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP9 的相互作用有益于病毒复制[18]。

藏猪是我国特有的能适应高原环境的一个重要品种[19]，有极强的环境适应性、抗病力强、耐粗饲、肉嫩味美，素有“高原之珍”的美誉[20]。有研究表明，藏猪和大约克猪的背膘厚、瘦肉率、肌内脂肪含量等存在明显差异[21‑22]。鉴于此，对ANXA2基因进行单核苷酸多态性（SNP）及组织表达差异分析，探究ANXA2基因对藏猪脂肪沉积的影响，旨在为藏猪的分子育种研究提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 材料 以西藏农牧学院教学实习牧场和林芝宇高生态农业开发有限公司养殖基地饲养的藏猪（TP）、大约克猪（YY）为研究对象。采集藏猪和大约克猪的耳组织样品，置75%乙醇中，-20 ℃保存，用于DNA 提取。屠宰180 日龄的藏猪和大约克猪，分别采集肝脏、腹脂及背脂组织，立即放入RNA保存液，液氮速冻，返回西藏农牧学院动物遗传育种与繁殖实验室放于-80 ℃冰箱保存，用于后续RNA提取。

1.1.2 主要试剂与仪器 RNase-Free ddH2O、Fastking cDNA 第 一 链 合 成 试 剂 盒、2×PowerTaqPCR Master Mix（Bioteke Gorporation 公 司 生 产）、Super Real PreMix Plus（SYBR Green）等均购自天根生化科技（北京）有限公司；Trizol 试剂购自Thermo Fisher Scientific公司（美国）。

PCR 仪购自北京奥秘佳得医药科技有限公司；实时荧光定量PCR 仪购自上海土森视觉科技有限公司。

1.2 DNA、RNA提取及cDNA制备

采用苯酚-氯仿法从藏猪和大约克猪的耳组织样品中提取DNA，将其溶解在RNase-Free ddH2O中，用1%琼脂糖凝胶电泳验证DNA 的质量，用NanoDrop 2000 分光光度计检测DNA 的浓度，置于-20 ℃冰箱保存备用。

采用Trizol 法提取肝脏、腹脂及背脂组织的RNA，将其溶解在RNase-Free ddH2O 中，用Nano‑Drop 2000 分光光度计检测RNA 的浓度，用1%琼脂糖凝胶电泳验证RNA 的质量，置于-80 ℃冰箱保存备用。

采用Fastking cDNA 第一链合成试剂盒对RNA进行反转录，用NanoDrop 2000 分光光度计检测cDNA的浓度，所得cDNA保存于-20 ℃冰箱。

1.3 引物设计及合成

1.3.1 SNP 筛选引物设计与合成 登录GenBank，下载ANXA2基因（登录号:NC_010443）序列。采用Primer Premier 5.0 软件和NCBI 在线引物设计相结合的方式设计ANXA2基因5′侧翼区的引物，序列见表1。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物合成后用RNase-Free ddH2O 溶解，4 ℃保存。

表1 猪ANXA2基因SNP筛选引物信息Tab.1 The primer information for SNP screening in pig ANXA2 gene

1.3.2 实时荧光定量PCR 的引物设计与合成

首先在NCBI官网（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下载猪ANXA2基因的mRNA 序列，选取DRAP1（登录号：XM_0031225183）作为内参基因，利用Primer Premier 5.0 软件设计实时荧光定量PCR 引物设计，信息见表2。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。合成后用RNase-Free ddH2O 溶解，于4 ℃保存。

表2 实时荧光定量PCR的引物信息Tab.2 The primer information for real-time fluorescence quantitative PCR

1.4 ANXA2基因PCR扩增

PCR 扩增体系20 μL：DNA 模板1 μL，RNase-Free ddH2O 8 μL，上、下 游 引 物（10 μmol/L）各0.5 μL，2×PowerTaqPCR Master Mix 10 μL。

PCR 反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55.2 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共36 个循环；72 ℃延伸3 min，4 ℃保存。

将PCR 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，检测合格的PCR 产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

1.5 基因频率与基因型频率检测、转录因子预测

选取藏猪和大约克猪各10头，采用Sanger测序法对ANXA2基因的PCR 产物进行混池测序，采用DNAMAN 6.0、Chromas Pro 软件相结合的方式对混池测序结果进行分析，筛选SNP 位点；针对所筛选出的SNP 位点扩大个体测序，计算基因型频率与基因频率。应用在线预测软件JASPAR（http://jaspar.genereg.net/）对ANXA2基因的突变位点进行转录因子预测。

1.6 实时荧光定量PCR检测

以ANXA2基因cDNA 为模板，选用DRAP1为内参基因，每个待测的藏猪和大约克猪样品各设置3个重复。

PCR 反应体系20 μL：上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，SYBR Green Mix 10 μL，cDNA 模板1 μL，RNase-Free ddH2O 8 μL。利用实时荧光定量PCR仪进行扩增。采用2-ΔΔCt方法计算ANXA2基因的相对表达量。

1.7 数据处理

利用Sigma plot 软件对ANXA2基因相对表达量进行双因素（品种和组织）分析，以平均值±标准差作图，并利用SPSS 25.0 软件对ANXA2基因表达量进行差异显著性分析；运用Excel 软件计算各个突变位点的基因频率和基因型频率，使用卡方检验对ANXA2基因的基因型频率和基因频率进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 ANXA2基因PCR扩增结果

PCR 扩增结果显示，有长约915 bp 的清晰条带（图1），与目的条带片段大小相符，PCR 扩增产物满足后续测序质量要求。

图1 藏猪和大约克猪ANXA2基因PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification products of ANXA2 gene from Tibetan pigs and Yorkshire pigs

2.2 不同组织ANXA2基因相对表达量变化

ANXA2基因在藏猪和大约克猪的肝脏、腹脂、背脂的mRNA 相对表达量结果见图2。在肝脏中，ANXA2基因在藏猪和大约克猪上的表达量差异不显著（P>0.05）；在背脂和腹脂中，ANXA2基因在藏猪中的表达量均极显著低于大约克猪（P<0.01）。

图2 ANXA2基因在藏猪、大约克猪的肝脏、腹脂和背脂中mRNA相对表达量Fig.2 Relative mRNA expression levels of ANXA2 gene in liver，abdominal fat and back fat of Tibetan pigs and Yorkshire pigs

2.3 ANXA2基因型频率和等位基因频率分布

测序结果（图3）显示，ANXA2基因共有g.111574291G>A、g.111574499C>T、g.111574522G>C和g.111574638A>G 4个突变位点。

图3 ANXA2基因5′侧翼区SNP筛选Fig.3 SNP screening of ANXA2 gene in 5′flanking sequencing

突变位点g.111574291G>A，在藏猪中存在GG型、GA 型，在大约克猪中存在GG 型、GA 型、AA 型，G基因为优势等位基因；突变位点g.111574499C>T，在藏猪中存在CC 型、CT 型，在大约克猪中存在TT型、CT 型、CC 型，C 基因为优势等位基因；突变位点g.111574522G>C，在藏猪和大约克猪中均存在GG型、GC 型，G基因为优势等位基因；突变位点g.111574638A>G，在藏猪中存在GG 型、AA 型和AG型，G 基因优势等位基因，在大约克猪中存在GG型、GA型、AA型，A基因为优势等位基因。

基因型频率、基因频率及卡方检验结果如表3所示，ANXA2基因4 个突变位点（g.111574291G>A、g.111574499C>T、g.111574522G>C 和g.111574638 A>G）均符合哈迪-温伯格（Hardy-Weinberg）平衡，在藏猪和大约克猪中，g.111574291G>A 突变位点存在显著差异（P<0.05），g.111574499C>T、g.11157452 2G>C 和g.111574638A>G 这3 个突变位点存在极显著差异（P<0.01）。

表3 ANXA2基因多态性位点基因型频率和等位基因频率Tab.3 ANXA2 gene polymorphism loci genotype frequency and gene frequency

2.4 ANXA2基因转录因子预测结果

通过在线预测软件JASPAR 分析可知，ANXA2基因g.111574291G>A 位点突变前存在6 个转录因子，突变后存在1 个转录因子，有5 个转录因子消失；g.111574638A>G 位点突变前存在1 个转录因子，突变后消失；g.111574522G>C 位点突变前后转录因子无变化；g.111574499C>T 位点突变前存在3个转录因子，突变后有2 个转录因子消失，新增3个转录因子，为Arid3a、CUX1和CUX2。

3 结论与讨论

本研究在ANXA2基因5′侧翼区筛选到4 个新的SNP 位点（g.111574291G>A、g.111574499C>T、g.111574522G>C和g.111574638A>G）。转录因子预测发现，g.111574499C>T 位点碱基突变后出现了新的转录因子Arid3a、CUX1、CUX2。其中，Arid3a 蛋白为ARID 家族的一员，是序列特异性的转录因子，有靶向结合启动子的功能，在细胞生长发育和分化中有重要作用[23]。CUX 又称为Cut-like（CUTL），属于转录因子同源结构域CCAAT 置换蛋白（CCAAT displacement protein，CDP）家族的成员，常常作为转录激活因子或转录抑制因子发挥作用[24]。在高等脊椎动物体内，CUX 存在CUX1 和CUX2 两种基因[25]。CUX1 是一种转录抑制因子，参与许多细胞基因的转录抑制[26]，可以调节与脂肪质量相关基因的表达[27]。还有研究表明，Arid3a与CUX相互作用，通过结合促进剂和增强子相关基质附着区域（MARS）来调节免疫球蛋白重链（IGH）基因转录[28]。推测Arid3a 与CUX 也有可能相互作用，通过某种机制调控ANXA2基因的表达，从而影响猪的脂肪代谢。

本研究中，ANXA2基因在藏猪背脂和腹脂中的表达量均极显著低于大约克猪（P<0.01），推测ANXA2基因促进猪的脂肪代谢。有研究表明，在白色脂肪组织的内皮细胞和脂肪细胞中，ANXA2蛋白能结合抑制素和脂肪酸转运体CD36，从而提高机体对脂肪酸的摄取，而且还能使脂肪酸从内皮细胞运输到脂肪细胞，ANXA2基因的表达与脂肪沉积有关[29]，与本研究结果一致。另有研究表明，ANXA2基因在奶牛脂肪组织代谢调节中起着关键作用[30‑31]。藏猪是脂肪型猪种，大约克猪是瘦肉型猪种。本研究中，ANXA2基因在藏猪背脂和腹脂中的表达量均极显著低于大约克猪，可能是因为大约克猪作为非高原猪种，长期处于高原环境下，由于体力活动的变化增加了所需的Ca2+水平，促进了ANXA2基因的表达，有利于ANXA2 蛋白与其他分子结合[32]。据此推测，g.111574499C>T 位点可能是调控ANXA2基因表达的关键功能位点，突变导致ANXA2基因负向调控脂肪沉积。与本研究中ANXA2基因在藏猪的腹脂和背脂中的表达情况一致，但具体调控机制和功能仍需进一步研究。

综上，ANXA2基因在藏猪和大约克猪的背脂和腹脂的表达量存在极显著差异，对筛选出的突变位点进行转录因子预测，发现突变后产生了新的转录因子，新的转录因子在细胞生长发育和分化中发挥重要作用。推测ANXA2基因可能是调控脂肪沉积和脂肪代谢的重要候选基因。