血清学自身抗体阴性类风湿关节炎患者抗氨基甲酰化蛋白抗体的检测及临床意义

吴滔 陈楚涛 杨莉娟 邹耀威 马剑达 徐延卉 贾磊 戴冽

【摘要】目的 探討血清学自身抗体阴性类风湿关节炎（RA）患者抗氨基甲酰化蛋白（CarP）抗体水平及其临床意义。方法 纳入301例RA患者及55名健康体检者作为正常对照。收集患者的人口学特征和临床资料包括血清RF和抗环瓜氨酸肽（CCP）抗体水平，采用ELISA检测IgG型抗CarP抗体水平。结果 根据正常对照组的第95个百分位数确定抗CarP抗体滴度的正常参考值范围为 ≤31 U/ml。在301例RA患者中，RF、抗CCP抗体及抗CarP抗体阳性率分别为74.8%（225/301）、75.1%（226/301）和15.9%（48/301）。其中RF阴性的RA患者、抗CCP抗体阴性的RA患者抗CarP抗体的阳性率分别为19.7%（15/76）和20.0%（15/75）。在RF阴性的RA患者中，若增加抗CCP抗体的检测，可使抗体阴性的RA患者减少39.5%（30/76）;若增加抗CarP抗体的检测，可使抗体阴性的RA患者减少19.7%（15/76）;若同时增加抗CCP抗体和抗CarP抗体的检测，可使抗体阴性的RA患者减少50.0%（38/76）。在46例RF和抗CCP抗体均阴性的血清阴性RA患者中，若增加抗CarP抗体的检测，可使血清阴性的RA患者减少17.4%（8/46）。结论 临床上增加抗CarP抗体的检测对血清学自身抗体阴性RA患者具有一定的补充诊断价值，血清阴性RA的诊断仍是临床目前的难点。

【关键词】类风湿关节炎;抗氨基甲酰化蛋白抗体;类风湿因子;诊断;抗环瓜氨酸肽抗体

【Abstract】Objective To probe into the level and clinical significance of anti-carbamylated protein （CarP） antibody in serologically negative patients with rheumatoid arthritis （RA）. Methods A total of 301 RA patients and 55 healthy controls were recruited. Demographic characteristics and clinical data including serum levels of rheumatoid factor （RF） and anti-cyclic citrullinated peptide （CCP） antibody were collected. Serum levels of IgG anti-CarP antibody were determined by ELISA. Results According to the 95th percentile of the anti-CarP antibody level in 55 healthy controls， the ceiling of normal value was ≤31 U/ml. Among 301 RA patients， the positive rates of RF， anti-CCP antibody and anti-CarP antibody were 74.8% （225/301）， 75.1% （226/301） and 15.9% （48/301）， respectively. The positive rates of anti-CarP antibody were 19.7% （15/76） in RA patients with negative RF and 20.0% （15/75） in RA patients with negative anti-CCP antibody， respectively. In negative-RF RA patients， additional detection of anti-CCP antibody could reduce the percentage of serologically negative RA patients by 39.5% （30/76）. Additional detection of anti-CarP antibody could lower the percentage by 19.7% （15/76）. Additional detection of both anti-CCP antibody and anti-CarP antibody could decrease the percentage by 50.0% （38/76）. In serologically negative RA patients （negative for both RF and anti-CCP antibodies）， additional detection of anti-CarP antibody could lower the percentage of serologically negative RA patients by 17.4% （8/46）. Conclusion Additional detection of anti-CarP antibody has supplementary value for the diagnosis of serologically negative RA which is currently a difficult issue in clinical practice.

【Key words】Rheumatoid arthritis; Anti-carbamylated protein antibody; Rheumatoid factor; Diagnosis;Anti-cyclic citrullinated peptide antibody

类风湿关节炎（RA）是一种常见的慢性炎症性自身免疫病，主要表现为受累关节滑膜炎症以及进行性且不可逆性软骨或骨破坏。然而，临床尚无有效的针对逆转软骨或骨破坏的治疗手段，因此RA的早期诊断与治疗尤为重要[1]。目前与RA诊断相关的血清学自身抗体主要有RF、抗环瓜氨酸肽抗体（抗CCP抗体），且均已纳入2010年美国风湿病学会/欧洲抗风湿病联盟（ACR/EULAR）联合修订的早期RA分类标准，对早期RA的识别和诊断具有较高的临床实用价值[2]。然而，临床上仍有1/4～1/3的RA患者RF及抗CCP抗体呈血清学阴性，容易被漏诊、误诊。这部分患者是目前临床RA诊断的难点，因此探索新型自身抗体的补充诊断价值尤为迫切[3]。

2011年Shi等[4]将氨基甲酰化胎牛血清作为反应抗原，首次发现在RA患者血清中存在抗氨基甲酰化蛋白抗体（抗CarP抗体），并且发现在临床前期RA及确诊RA患者的血清均能检测出抗CarP抗体，为RA的实验室诊断提供了新的指标。目前国内关于抗CarP抗体的临床研究较少[5]。本研究采用ELISA对RA患者血清的抗CarP抗体进行了检测，旨在了解RA患者抗CarP抗体水平及其临床意义。

对象与方法

一、研究对象

纳入2011年12月至2018年7月在我科就诊的RA患者，其诊断均符合2010年ACR/EULAR联合修订的早期RA分类标准[2]。排除合并其他风湿性疾病（如SLE、系统性硬化病、皮肌炎等）、严重感染、器官功能衰竭或恶性肿瘤的患者。正常对照组选自同期我院的健康体检者。本研究获中山大学孙逸仙纪念医院伦理委员会批准（SYSEC-2009-06和SYSEC-KY-KS-012），所有参与者均已签署知情同意书。

二、临床资料收集

收集RA患者的人口学特征和临床资料，包括年龄、性别、病程及RA疾病活动指标，RA活动指标包括28个肿胀关节数（28SJC）、28个压痛关节数（28TJC）、患者总体病情活动度评估（PtGA，0～10 cm）、医生总体病情活动度评估（PrGA，0～10 cm）、疼痛视觉模拟评分（VAS， 0～10 cm）、ESR、CRP，并计算基于CRP的28个关节疾病活动度评分（DAS28-CRP）、简化疾病活动指数（SDAI）和临床疾病活动指数（CDAI）。根据CDAI，将RA病情活动度分为缓解期（CDAI≤2.8）、低度活动期（2.822.0）。

三、RF、抗CCP抗体和抗CarP抗体水平的检测

RA患者和正常对照组入组的同时留取血清，?80 ℃冻存。RF采用散射比浊法检测（德国西门子公司），正常参考值范围为0～20 IU/mL。抗CCP抗体采用ELISA检测（德国AESKU公司），正常参考值范围为0～18 IU/mL。RF和抗CCP抗体均阴性为血清阴性RA患者，RF和（或）抗CCP抗体阳性则为血清阳性RA患者。RA患者和正常对照组血清中的IgG型抗CarP抗体采用ELISA测定（美国ABSCI-BIO公司）。用标准品的吸光度作为Y轴、浓度作为X轴建立标准曲线。样本的抗CarP抗体浓度根据标准品的标准曲线得出，抗CarP抗体滴度的正常参考值范围定义为正常对照组抗CarP抗体水平的第95个百分位数。

四、统计学分析

采用SPSS 25.0进行数据分析。正态分布的连续变量资料以  表示，组间比较采用t检验。非正态分布的连续变量资料，以M（P25， P75）表示，组间比较采用Mann-Whitney U检验。分类变量以例（%）表示，组间比较采用χ2检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

结果

一、RA患者的一般情况

本研究共纳入RA患者301例，其中女性238例（79.1%），年龄为（48.5±12.3）岁，中位病程48（13， 96）月。258例（85.7%）RA患者处于活动期，66例（21.9%）为低度活动期，101例（33.6%）为中度活动期，91例（30.2%）为高度活动期。血清阴性 RA患者共46例，占15.3%。与血清阳性RA患者相比，血清阴性 RA患者中女性占比高（91.3% vs. 76.9%）， 而其病情活动指标包括PtGA（3 cm vs. 5 cm）、疼痛VAS（3 cm vs. 4 cm）、ESR（24 mm/h vs. 41 mm/h）、CRP（5.6 mg/L vs. 10.4 mg/L）均较低（P均< 0.05），見表1。

二、抗CarP抗体滴度正常参考值范围的确定

共纳入55名健康体检者作为正常对照组，其中女40名（72.7%），年龄为（38.3±12.0）岁。以每份标准品（0、2、4、8、16、32、64 U/ml）的吸光度为Y轴，以相应的浓度为X轴建立标准曲线，读取样本抗体的浓度。由于正常对照组的抗CarP抗体滴度呈非正态分布，因此采用第95个百分位数确定抗CarP抗体滴度的正常参考值范围为≤31 U/mL，见图1。

三、RA患者抗CarP抗体的分布情况

301例RA患者中，RF、抗CCP抗体及抗CarP抗体阳性率分别为74.8%（225/301）、75.1%（226/301）和15.9%（48/301）。RF阳性和RF阴性RA患者抗CarP抗体的阳性率分别为14.7%（33/225）和19.7%（15/76），两者比较差异无统计学意义（χ? = 1.090，P = 0.297）。抗CCP抗体阳性和抗CCP抗体阴性的RA患者抗CarP抗体的阳性率分别为14.6%（33/226）和20.0%（15/75），两者比较差异无统计学意义（χ? = 1.224，P = 0.269）。血清阳性和血清阴性的RA患者抗CarP抗体的阳性率分别为15.7%（40/225）和17.4%（8/46），两者比较差异无统计学意义（χ? = 0.085，P = 0.771），见图2。

四、抗CarP抗体对血清阴性RA患者的补充诊断价值

301例RA患者中，若检测抗CarP抗体，阳性率为15.9%（48/301）。RF阴性的RA患者76例（25.2%），若增加抗CCP抗体的檢测，则可以使抗体阴性的RA患者减少39.5%（30/76）;若增加抗CarP抗体的检测，则可以使抗体阴性的RA患者减少19.7%（15/76）;若同时增加抗CCP抗体和抗CarP抗体的检测，则可使抗体阴性的RA患者减少50.0%（38/76），见图3。而在46例RF和抗CCP抗体均阴性的血清阴性RA患者中，增加抗CarP抗体检测，则可使血清阴性的RA患者减少17.4%（8/46）。

讨论

RA患者在出现临床症状、影像学及组织学变化前，即可在血清中检测到RA相关的自身抗体。RF是最早发现的RA自身抗体，可见于70%的RA患者，但特异性不强。它也可出现在RA以外的多种风湿性疾病和非风湿性疾病中，在约5%的正常人血清中也可检测到低滴度的RF。抗CCP抗体是于1998年被发现的另一种RA自身抗体，对RA的诊断具有较高的灵敏度和特异度，并且可在RA患者临床症状前4.5（0.1，13.8）年检测到，更有利于RA患者的早期诊断[6]。近年研究者发现，翻译后蛋白修饰产生自身抗体是RA的重要发病机制，修饰主要包括瓜氨酸化、氨甲酰化、乙酰化、甲基化、磷酸化等。除了RF和抗CCP抗体外，RA患者血清中还可检测到多种针对不同修饰蛋白的新型自身抗体，如抗突变型瓜氨酸波形蛋白（MCV）抗体、抗肽基精氨酸脱亚胺酶4（PAD4）抗体、抗瓜氨酸化α烯醇化酶多肽1（CEP-1）抗体和抗CarP抗体等[7]。这些新型自身抗体的检测是今后RA早期诊断、鉴别诊断、判断疾病的严重程度及预后评估等方面的重要研究方向。例如抗MCV抗体，有研究提示其对RA的诊断价值并不优于抗CCP抗体[8]。但在笔者团队的既往研究中，其对RA患者尤其是血清阴性的RA患者具有重要的补充诊断价值，并且与RA患者1年放射学关节破坏进展相关[9-10]。抗MCV抗体不仅能对RA诊断起到补充作用，也有助于评估病情活动及预测预后。

抗CarP抗体也属于翻译后蛋白修饰抗体，是由氨基甲酰化产生的自身抗体。氨基甲酰化的过程由氰化物介导，使赖氨酸转化为高瓜氨酸[11-13]。在生理条件下，人体内氰酸盐含量很低，并与尿素形成化学平衡。但在某些情况，如尿素水平升高、吸烟、炎症等，均可引起氰化物水平升高，继而导致氨基甲酰化水平增加，引起蛋白质和细胞功能障碍，并可破坏机体免疫耐受，导致抗CarP抗体的产生[12， 14]。文献报道，在14%～53%的RA患者血清中可检测到抗CarP抗体，其中以抗氨基甲酰化的胎牛血清抗体、抗氨基甲酰化的纤维蛋白原抗体和抗氨基甲酰化的波形蛋白抗体这3种类型最为多见[11， 15]。RA患者在出现早期症状或明确诊断之前即可在血清中检测到抗CarP抗体，且抗CarP抗体存在于几乎所有抗CCP抗体阳性以及10%～20%的抗CCP抗体阴性的RA患者体内[11]。本研究显示，RA患者抗CarP抗体的阳性率为15.9%，在抗CCP抗体阴性的RA患者中也有20%的患者抗CarP抗体阳性;但在抗CCP抗体阳性的RA患者中，抗CarP抗体的阳性率仅为14.6%，与国外文献报道不一致，提示不同地区、种族之间，抗CarP抗体可能存在一定的差异。

胎牛血清中含有氨基甲酰化蛋白质的混合物，因此实验室最常使用胎牛血清作为抗原检测抗CarP抗体[11， 13]。亦有研究者使用其他的CarP，如丝蛋白、波形蛋白、烯醇酶和胶原作为抗原[11]。国外文献大多数报道用胎牛血清氰酸化孵育过夜作为包被抗原，建立ELISA检测体系，但有文献提出此抗原制备法得到的CarP水平较低且不稳定[16]。另外，由于组成抗原表位的高瓜氨酸残基的相邻结构可能存在差异，后续诱导产生的抗CarP抗体识别的抗原表位、亲和力及结合活性不尽相同，导致抗CarP抗体在RA患者中的阳性率出现较大差异[4]。因此在抗CarP抗体作为临床诊断指标前，亟需优化CarP抗原的制备程序，同时完善检测体系，以得到更准确、稳定的结果。此外，对于抗CarP抗体的正常参考值范围的确定尚无统一的标准。目前较常见的正常上限截断值为正常人抗CarP抗体滴度平均值+2个标准差或第95个百分位数[7]。正常参考值范围的确立亦会影响诊断的阳性率，因此，纳入足够样本的正常中国人数据、确定更精确的抗CarP抗体正常界值亦是保障该领域研究进展的基石。

Verheul等[17]的研究显示，RF、抗CCP抗体和抗CarP抗体同时阳性几乎仅出现在RA患者中，而在其他类型的早期关节炎中非常罕见，对早期关节炎的鉴别诊断起到了极大的作用，对于RA的诊断具有极高的特异度（98%～100%），提示在RF和抗CCP抗体的基础上检测抗CarP抗体对于潜在RA患者的识别、早期关节炎的鉴别诊断及临床RA的诊断都具有一定的价值。本研究显示，在RF和抗CCP抗体均呈阴性的血清阴性RA患者中抗CarP抗体的阳性率为17.4%，即在检测RF和抗CCP抗体的基础上增加抗CarP抗体的检测可进一步识别17.4%的血清学阴性RA。然而，荷兰莱顿大学医学中心前瞻性队列研究纳入838例未分化关节炎患者的随访结果发现，基线检测抗CarP抗体未能提高RA早期诊断的准确性，提示抗CarP抗体对未分化关节炎发展为早期RA的预测价值仍有待进一步研究[18]。另外，对于明确诊断的RA患者，抗CarP抗体与DAS28评分之间的关系尚不明确。研究者发现，抗CarP抗体阳性与RA患者的关节破坏进展相关[19]。一项针对3个欧洲人群的纵向队列研究结果提示，抗CarP抗体阳性会增加RA患者的总病死率，提示抗CarP抗体对于RA患者的预后有一定的预测价值[20]。

总之，作为RA自身抗体的新型标志物，抗CarP抗体的检测对血清学阴性RA患者具有一定的补充诊断价值，并且在病情评估及预后预测方面有一定的潜力，值得今后进一步进行大样本且长期的前瞻性研究。

参 考 文 献

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（收稿日期：2021-09-01）

（本文编辑：林燕薇）