黄绿绿僵菌与反式茴香脑的相容性及其对菜青虫的联合毒力

李 蕾，张 雷，赵宗祥，王梦茹，李世广

（安徽农业大学植物保护学院/植物病虫害生物学与绿色防控安徽普通高校重点实验室，合肥 230036）

菜粉蝶Pieris rapae的幼虫菜青虫是十字花科蔬菜上的重要害虫，目前国内外防治菜青虫主要以化学防治为主[1]。长期使用化学农药防治，会造成害虫抗药性，蔬菜农药残留超标及环境污染等一系列副作用，开发应用真菌制剂、植物次生代谢产物等进行生物防治是解决上述问题的重要途径[2,3]。

黄绿绿僵菌Metiarium flavoride是一种重要的昆虫病原真菌，广泛用于蔬菜害虫、地下害虫、牧草害虫、林业害虫等的生物防治，尤其对小菜蛾plutella xylostella、菜青虫、蚜虫、飞蝗Locusta migratoria、白蚁、桃小食心虫Carposina sasakii等防治效果俱佳，其防治效果可与白僵菌媲美[4]。

植物次生代谢产物反式茴香脑（trans-anethole）是茴香精油与罗勒精油的主要成分，经GC-MS分析反式茴香脑在茴香精油中占比91.32%，具抗氧化、抗真菌、细胞毒性等生物活性[5]。反式茴香脑对桃蚜Myzus persicae、埃及伊蚊Aedes aegypti、致倦库蚊Culex quinquefasciatus、粉纹夜蛾Trichoplusia ni、豇豆象Callosobruchus maculatus、沫蝉等多种害虫具杀灭活性[6-11]；还对桃小食心虫和米象Sitophilus oryzae具有驱避作用[12,13]；并且影响成虫寿命、产卵及抑制体内保护酶活性[5]。与化学杀虫剂相比，植物中的化合物属天然产物，对环境友好、易降解，符合无公害农业的发展潮流，可作为高毒高残留化学农药的替代品；天然产物通常杀虫效率高，成本低，比合成产物对非目标生物的危害小，而且它们具有可降解性，因而是对环境友好的天然杀虫剂[14]。

黄绿绿僵菌等生防真菌防治害虫具有持效性等优点，但缺乏速效性；据报道，反式茴香脑具有作为生物杀虫剂的潜力，而且有较强的速效性[11]。两种及以上药剂的联合使用越来越成为害虫防治的重要策略[15]，除了生物制剂与化学杀虫剂联合使用，真菌杀虫剂与天然植物代谢产物两种生物制剂联合使用也是有效提高害虫生物防治效果的重要途径。真菌杀虫剂与天然植物代谢产物混合施用的最低要求是使真菌孢子保持活力[2]。因此，本文评价了反式茴香脑对黄绿绿僵菌Mf82菌株菌丝生长和孢子萌发的影响，同时测定了反式茴香脑与黄绿绿僵菌 Mf82联合使用对菜青虫的毒力，以期为指导田间联用防治菜青虫提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

黄绿绿僵菌菌株Mf82由安徽农业大学植物保护学院植物病虫害生物防治研究室提供。用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）在温度（25±1）℃的恒温培养箱中培养形成菌落供试。

1.2 供试药剂

反式茴香脑（99%）购于美国Sigma-Aldrich公司。

1.3 供试昆虫

菜粉蝶采自安徽农业大学农翠园未喷药的甘蓝地，移入室内养虫室用白菜或甘蓝盆栽进行连续多代饲养，饲养条件为温度（25±1）℃，相对湿度 75%，光周期 14L:10D。选取体型大小一致、健康活泼的 2龄幼虫供试。

1.4 黄绿绿僵菌Mf82对菜青虫的生物测定

刮取供试菌株分生孢子在0.05% Tween-80溶液中，分别配制成1.5×104～1.5×108孢子/mL的5个浓度梯度孢子悬浮液，每个浓度3个重复，每个重复15头2龄幼虫，设0.05% Tween-80水溶液为对照。采用浸渍法接种[14]，将每重复的15头幼虫挑选放置在干净的白纱布中，用镊子夹着带有菜青虫的纱布在各浓度的孢子悬浮液中浸10 s，拿出后放于滤纸上吸干虫体表面多余水分，再放在垫有新鲜甘蓝叶片的培养皿中，于25 ℃、相对湿度75%，光周期0L:24D 恒温培养箱饲养观察，连续观察记录5～6 d，计算校正死亡率。

1.5 反式茴香脑对菜青虫的生物活性测定

用5%丙酮水溶液将反式茴香脑配制成5个浓度，即1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、2.5 mg/mL、5.0 mg/mL和7.5 mg/mL，以5%丙酮水为对照。采用浸渍法接种，方法同1.4。分别于处理后的6 h、12 h、24 h、36 h、48 h观察记录死亡虫数，并计算处理试虫48 h后的LC50。

1.6 反式茴香脑对菌株Mf82菌丝生长影响的测定

反式茴香脑药剂LC50分别与上述5个浓度孢子悬浮液以体积比5:5、4:6、3:7、2:8和1:9分别混合在1.5 mL离心管里，用灭过菌的200 μL移液枪头在PDA平板中央戳一个小浅坑，用移液枪吸取5 μL各处理组混合药剂，点接到平板中央的浅坑里，对照组点接不加药剂的各浓度孢子悬浮液，接种用量和方法保持一致[16]，各处理组重复5次，移入光照培养箱中培养，温度（25±1）℃，相对湿度75%，光周期0L:24D。从第2 d开始在平板底部采用十字交叉法测量菌落直径，连续测量10 d，以测量所得的各个重复的平均值为菌落直径。利用下式计算菌落生长抑制率：菌丝生长抑制率（%）＝（1－处理组菌落直径/空白组菌落直径）×100。

1.7 反式茴香脑对菌株Mf82孢子萌发影响的测定

以不加药剂的孢子悬浮液为对照，将反式茴香脑药剂LC50分别与上述5个浓度孢子悬浮液以不同比例混合后的药剂放入光照培养箱中，24 h后测定分生孢子萌发情况，计算孢子萌发百分率。吸取10 μL药液在载玻片上，于光学显微镜10×40倍下观察孢子萌发情况，每个玻片随机计数5个视野。当胚芽管长于分生孢子直径时，即确定为分生孢子已萌发[17,18]。利用下式计算孢子萌发率和校正孢子萌发率，孢子萌发率（%）＝（萌发孢子数/观察孢子总数）×100，校正孢子萌发率（%）＝（处理组孢子萌发率/对照组孢子萌发率）×100。

1.8 反式茴香脑与黄绿绿僵菌Mf82联合使用对菜青虫的生物活性测定

按照所求反式茴香脑药剂LC50与配制好的孢子悬浮液（1.5×104～1.5×108孢子/mL）以体积比5:5、4:6、3:7、2:8和1:9分别混合，浸渍接种。对照组按照0.05% Tween-80和5%丙酮水溶液按相应比例混合接种，方法参照1.4。单剂毒力指数（TI）＝标准药剂LC50/供试药剂LC50×100；混合药剂实测毒力指数（ATI）＝标准药剂LC50/混合药剂LC50×100；混合药剂理论毒力指数（TTI）＝混合药剂中A的毒力指数×混剂中A所占比例（A%）＋混合药剂中B的毒力指数×混剂中B所占比例（B%）；共毒系数（CTC）＝混合药剂实测毒力指数ATI/混合药剂理论毒力指数TTI×100。

在测定两种药剂对菜青虫的联合毒力时以黄绿绿僵菌为标准药剂A，则黄绿绿僵菌的毒力指数为100。若计算得到共毒系数＞120，则为增效作用；80＜共毒系数≤120，为相加作用；共毒系数＜80，为拮抗作用[19]。

1.9 数据统计与分析

数据的分析与处理采用SPSS 22.0，计算平均值、标准误、毒力回归方程、LC50及95%置信限，对于不同处理组间采用一维方差分析（One-Way ANOVA）中的最小差异显著法（LSD Test）进行多重分析，差异显著性水平为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 黄绿绿僵菌Mf82对菜青虫的校正死亡率

黄绿绿僵菌孢子悬浮液对菜青虫2龄幼虫的毒力随着浓度的升高而增强，处理5 d时菌株Mf82浓度为1.5×106孢子/mL、1.5×107孢子/mL、1.5×108孢子/mL孢子悬浮液对菜青虫2龄幼虫的校正死亡率分别为81.08%、91.89%和97.30%；并且同一浓度随着时间延长试虫死亡率显著上升，从处理后第2 d开始各供试浓度的试虫死亡率上升明显（表1）。

表1 黄绿绿僵菌Mf82不同浓度分生孢子悬浮液对菜青虫的累计校正死亡率Table 1 Cumulative corrected mortality ofM. flavoride82 with different concentrations againstP. rapae

2.2 反式茴香脑对菜青虫的校正死亡率

不同浓度的反式茴香脑对菜青虫的累计校正死亡率见表2。反式茴香脑对菜青虫的毒力随浓度的升高而显著增强。在施药处理6 h后最高浓度7.5 mg/mL表现出低死亡率，随着时间延长各浓度死亡率明显升高，在处理48 h 时，1.0 mg/mL的校正死亡率超出20.00%，5.0 mg/mL和7.5 mg/mL对菜青虫的校正死亡率分别达到了92.68%和97.56%，且各浓度死亡率差异显著（F＝47.742，df＝5，P＝0.000）。

表2 反式茴香脑不同浓度对菜青虫的累计校正死亡率Table 2 Cumulative corrected mortality of trans-anethole with different concentrations againstP. rapae

由Probit analysis分析得到反式茴香脑处理菜青虫48 h后的LC50为1.495 mg/mL，因此，选取反式茴香脑致死中浓度LC501.495 mg/mL对本文接下来菌药相容性及菌药混合使用效果进行下一步探究。

2.3 反式茴香脑对菌株Mf82菌丝生长的影响

反式茴香脑与Mf82菌株孢子悬浮液各浓度以5个不同体积比混合后均能促进菌落生长，与反式茴香脑具较好的相容性，但随着时间的延长，菌落生长速率减慢（表3）。

表3 反式茴香脑LC50对黄绿绿僵菌Mf82菌落生长的影响Table 3 Effect of LC50of trans-anethole on the mycelia growth ofM. flavorideMf82

2.4 反式茴香脑对菌株Mf82孢子萌发的影响

菌株Mf82不同浓度的孢子悬浮液的孢子萌发率不同，高浓度孢子悬浮液与反式茴香脑LC50混用其孢子萌发率更高。TA LC50＋Mf828在各混合比例中均能促进菌株Mf82孢子萌发，孢子萌发率96.13%～111.03%，各混合比例间差异显著（F＝3.740，df＝4，P＝0.034）；TA LC50＋Mf827在各混合比例中孢子萌发率在75.00%以上，各混合比例间差异显著（F＝4.810，df＝4，P＝0.015），其中，二者以体积比5:5和4:6混合后绿僵菌分生孢子萌发率均超过90.00%，分别为94.68%和93.07%；TA LC50＋Mf826、TA LC50＋Mf825与TA LC50＋Mf824的混合处理中反式茴香脑所占比例越高，孢子萌发率越高（TA LC50＋Mf826：F＝3.510，df＝4，P＝0.037；TA LC50＋Mf825：F＝3.783，df＝4，P＝0.028；TA LC50＋Mf824：F＝3.434，df＝4，P＝0.044）（表4）。

表4 反式茴香脑对菌株Mf82孢子萌发的影响（24 h）Table 4 Effect of trans-anethole to conidia germination ofM. flavorideMf82 (24 h)

2.5 反式茴香脑与黄绿绿僵菌Mf82联合使用对菜青虫的校正死亡率

反式茴香脑LC50与同一浓度孢子悬浮液以不同体积比混合后，混剂中反式茴香脑占比越大，试虫死亡率越高，而且以5:5、4:6和3:7混合后的试虫死亡率高于孢子悬浮液单用的死亡率，2:8和1:9混合后试虫死亡率低于单用，且死亡率随时间的延长而升高。处理后第5 d，TA LC50＋Mf828（5:5）、TA LC50＋Mf828（4:6）和TA LC50＋Mf828（3:7）处理组试虫死亡率达100.00%，比TA LC50＋Mf828（2:8）和TA LC50＋Mf828（1:9）组死亡率高；各浓度孢子悬浮液处理后，两者混合处理试虫死亡率为：TA LC50＋Mf827（5:5）＞TA LC50＋Mf827（4:6）＞TA LC50＋Mf827（3:7）＞TA LC50＋Mf827（2:8）＞TA LC50＋Mf827（1:9）；TA LC50＋Mf826（5:5）＞TA LC50＋Mf826（4:6）＞TA LC50＋Mf826（3:7）＞TA LC50＋Mf826（2:8）＞TA LC50＋Mf826（1:9）；TA LC50＋Mf825（5:5）＞TA LC50＋Mf825（4:6）＞TA LC50＋Mf825（3:7）＞TA LC50＋Mf825（2:8）＞TA LC50＋Mf825（1:9）；TA LC50＋Mf824（5:5）＞TA LC50＋Mf824（4:6）＞TA LC50＋Mf824（3:7）＞TA LC50＋Mf824（2:8）＞TA LC50＋Mf824（1:9）（表5）。

表5 反式茴香脑与黄绿绿僵菌Mf82联合使用对菜青虫的校正死亡率Table 5 Laboratory toxicity of mixedM. flavorideMf82 with trans-anethole againstP. rapae

2.6 反式茴香脑与黄绿绿僵菌Mf82联合使用对菜青虫的毒力

反式茴香脑LC50与绿僵菌5个浓度以不同体积比混合后，其混剂的LC50大小顺序为：TA LC50＋Mf82（5:5）＜TA LC50＋Mf82（4:6）＜TA LC50＋Mf82（3:7）＜TA LC50＋Mf82（2:8）＜TA LC50＋Mf82（1:9），说明混合后的毒力随着反式茴香脑在混剂中所占比例的减少而降低；反式茴香脑LC50与菌株Mf82（浓度1.5×108、1.5×107、1.5×106、1.5×105和1.5×104孢子/mL）以体积比5:5混合后，CTC为287＞120，说明两者以5:5混用具协同增效作用；同理，反式茴香脑LC50与菌株Mf82以体积比4:6和3:7混合后，CTC分别为108和83，在80～120，说明两者以体积比4:6和3:7混合后对菜青虫的毒力具相加作用；而反式茴香脑LC50与菌株Mf82以体积比2:8和1:9混合后，共毒系数分别为32和16，明显小于80，说明菌药混合表现拮抗作用。从联合作用中药剂LC50与单用药剂的LC50的比值中也可看出，二者以体积比5:5、4:6、3:7混合后比值均显著小于1，说明联用不仅可以减少药剂的使用量，还具增效作用；二者以体积比2:8混合后比值0.86趋于1，说明联合使用具相加作用；反之，二者以体积比1:9混合后比值大于1，联用不具增效作用（表6）。

表6 反式茴香脑与黄绿绿僵菌Mf82对菜青虫的联合毒力Table 6 The combined toxicity of trans-anethole andM. flavorideMf82 on the 2ndinstar larvae ofP. rapae

反式茴香脑LC50与黄绿绿僵菌孢子悬浮液5个浓度以不同比例混合处理试虫后，各个比例所得的LT50差异明显，二者以体积比5:5、4:6和3:7联合使用的LT50明显比菌株Mf82单用的LT50短，而以体积比2:8和1:9联用的LT50比菌株单用时的LT50长（表7）。

表7 黄绿绿僵菌Mf82与反式茴香脑联合使用对菜青虫的致死中时Table 7 LT50ofM. flavorideMf82 with trans-anethole againstP.rapae

3 讨论

本研究发现黄绿绿僵菌Mf82菌株与反式茴香脑联合使用不仅提高了黄绿绿僵菌Mf82菌株对菜青虫的毒力，而且致死速度加快。菌株Mf82在浓度1.5×107孢子/mL处理5 d后足以使菜青虫死亡率在90.00%以上。有研究也显示了在较高浓度昆虫病原真菌孢悬液作用下，对靶标害虫的控制效果好。例如，Duarte等[2]选用浓度为107孢子/mL的球孢白僵菌、绿僵菌属、莱氏绿僵菌在防治小菜蛾2龄幼虫7 d后校正死亡率就已达到98.00%、100.00%和95.00%。在处理48 h时，反式茴香脑浓度5.0 mg/mL和7.5 mg/mL对菜青虫的校正死亡率就分别达到了92.68%和97.56%，这与Rana等[8]证实了十种芳香植物精油及其主要成分（其中包括反式茴香脑）在处理浓度仅为0.25 mL/L时，2 h内对致倦库蚊4龄幼虫的致死率为100.00% 的结论相似，均表明反式茴香脑对靶标害虫的速效性。

研究菌药相容性的报道很多，但多集中在昆虫病原真菌与化学杀虫剂的联合应用上，针对黄绿绿僵菌与植物次生代谢产物相容性的研究则鲜有报道。高毒力菌株绿僵菌分生孢子耐受性强，与其他药剂混合后，对菌落生长影响小[20,21]。张英财等[22]报道了18种化学农药与绿僵菌的相容性，结果表明杀虫剂、除草剂、植物生长调节剂在田间推荐浓度下对绿僵菌菌落生长及孢子萌发影响不显著，相容性好。本试验中反式茴香脑对黄绿绿僵菌的菌落生长和孢子萌发有一定的促进作用，与化学药剂对真菌营养生长的影响相反，这与诸多学者研究昆虫病原真菌与农药的相容性而得出植物源农药与真菌的相容性较好，而化学农药对真菌的抑制率较大的结论一致[23-25]。黄绿绿僵菌与反式茴香脑的相容性，可能与反式茴香脑的化学分子在混剂中的低剂量对微生物低毒性有关，也可能与昆虫病原真菌具有降解这些化合物的能力，以最终不影响自身菌落繁殖有关[26]。

昆虫病原真菌与植物代谢产物复配目的就是为了提高灭杀效果，降低化学防治造成的环境压力，扩展生物农药的灭杀谱，从而提高产品的应用范围与商业价值[27]。当反式茴香脑 LC50与黄绿绿僵菌以体积比5:5、4:6和3:7联合使用时，试虫死亡率高于2:8与1:9混用的死亡率，共毒系数分别为287、108和83，说明具有增效与相加作用；而且反式茴香脑与黄绿绿僵菌联用比黄绿绿僵菌单用的LT50缩短，因此联合使用效果更好。原因可能是因为混剂中高比重反式茴香脑影响幼虫的神经系统，与已经侵入到体内的黄绿绿僵菌结合破坏昆虫免疫系统而导致更高的死亡率，也可能是反式茴香脑导致昆虫停止取食和延迟发育，从而增加真菌侵染造成的死亡率[28-30]。另一方面，由于绿僵菌分生孢子产生的芽管分泌溶几丁质酶和蛋白酶，溶解昆虫体壁，使得其他药剂能快速进入昆虫体内，共同作用加速昆虫死亡[31]。此外，同一药剂在不同浓度范围内与绿僵菌联用效果存在差异，这可能与药剂的组分类型、作用机制、环境因素及混剂中其有效成分含量多少有关。

综上所述，本文对黄绿绿僵菌Mf82与反式茴香脑菌药相容性及其对菜青虫联合作用的研究结果表明，反式茴香脑具备防治菜青虫的潜力，可作为生物源农药进行商业化推广。防治菜青虫时推荐使用黄绿绿僵菌Mf82与反式茴香脑联用，并且优先选用反式茴香脑LC50与黄绿绿僵菌以体积比5:5、4:6和3:7处理组使用。推广黄绿绿僵菌和反式茴香脑联用防治菜青虫，既能发挥昆虫病原真菌的持效性与植物代谢物的速效性，还能缓解化学农药使用带来的“3 R”危害，保证蔬菜生产的安全性；但黄绿绿僵菌Mf82和反式茴香脑联合作用的最佳使用条件及其对菜青虫的田间防效还需进一步研究。