金龟子绿僵菌对褐飞虱繁殖力的影响

康 奎，蔡尤俊，龚 俊，张道伟*

（1.遵义师范学院生物与农业科技学院/贵州省赤水河流域动物资源保护与应用研究重点实验室，遵义 563002；2.中山大学生命科学学院/有害生物控制与资源利用国家重点实验室，广州 510275）

褐飞虱Nilaparvatalugens（Stål），以单食水稻为主，是亚太地区一种重要的农作物经济害虫。以其繁殖力强、具迁飞性的特点在种植水稻的国家肆虐，已被国际应用生物科学中心（CABI）列为世界十大害虫之一。褐飞虱旺盛的繁殖力是造成水稻经济严重损失的主要原因之一，褐飞虱的繁殖受卵巢发育和环境条件的调控，强大的繁殖能力是褐飞虱大面积暴发的基础[1]。害虫的繁殖主要基于卵巢的发育程度，卵巢的发育由卵黄蛋白（Vitellin，Vn）直接提供营养物质，而卵黄蛋白原（Vitellogenin，Vg）是卵黄蛋白的前体物质，有许多研究表明卵黄原蛋白基因Vg对于昆虫的繁殖力有着非常重要的影响[2-4]。因此作为 Vn前体物质的Vg在卵黄发育过程中对昆虫卵巢的成熟起着举足轻重的作用。

雌性害虫的繁殖力决定了害虫的虫源基数，为了控制农业害虫的数量，有机杀虫剂由于其快速有效的特点被滥用，然而有机杀虫剂的不合理使用给农业生态环境造成了严重的污染，带来了如“3R”（抗药性、残留和害虫再猖獗）等一系列问题[5]，害虫对有机杀虫剂的抗药性也不断增强，据悉，至少有586种昆虫对325种杀虫剂中的至少一种产生抗药性[6]。本着对水稻优质高产的利益出发，绿色防控将成为现代农业生产的必要趋势。

近年来，微生物杀虫剂因为环境友好型的特性正在蓬勃发展，特别是昆虫病原真菌已经作为重要的生物防治制剂用于各类害虫的防治[7,8]。金龟子绿僵菌Metarhiziumanisopliae是一种被广泛使用的昆虫病原真菌，据报道能感染包括鳞翅目、膜翅目、双翅目、鞘翅目在内的200多种农业害虫[9-11]，还能寄生螨类及线虫，但是绿僵菌对人畜无害[12]，且这种真菌对水稻微生物群落没有实质性影响[13]。所以，绿僵菌是极其适合作为生物农药的真菌[14]。绿僵菌可掩盖自身菌丝体细胞壁的抗原结构成分，防止血细胞识别[15]，在附于宿主表面的分生孢子正常萌发后分泌几丁质酶、蛋白酶、脂肪酶等水解酶，逐渐累积，将宿主体表几丁质和蛋白质水解，破坏宿主体表侵入到宿主内部[16,17]，随着绿僵菌的侵染程度不断加重，宿主抵抗力下降、行动缓慢、机体衰弱，最后营养衰竭而死[18]，此外还能在寄主体内分泌绿僵菌素，抑制寄主的免疫效应[19,20]，加剧宿主的死亡。绿僵菌的传播可减少如鳞翅目[21]、蜚蠊目[22]、双翅目[23]等昆虫的产卵量，对若虫的数量具有潜在的控制能力。

已有研究发现绿僵菌对稻飞虱、二化螟Chilosuppressalis、卷叶螟Cnaphalocrocismedinalis等多种水稻害虫有较好的防治效果，但关于绿僵菌是否能对褐飞虱的繁殖有影响还缺少研究，本研究可为绿僵菌控制褐飞虱的繁殖潜力提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫与病原真菌

褐飞虱种群由广东省农业科学院植物保护研究所提供，在昆虫饲养温室中用分蘖期的黄华占水稻品种饲养，饲养温室的温度（27±2）℃，相对湿度（80±10）%，光周期16L:8D。佛冈基地饲养水稻为柯博士有机稻，水稻品种为常规品种，对褐飞虱为弱抗性。

供试病原真菌为重庆大学提供的8×1010孢子/mL金龟子绿僵菌悬浮剂。

1.2 金龟子绿僵菌悬浮剂生物活性室温检测

将8×1010孢子/mL金龟子绿僵菌悬浮剂按1:500的比例兑水稀释，装入超低容量喷雾器进行低容量喷雾。取6个养虫笼各放入3盆长势相近的黄华占水稻，在每盆水稻上接入30头4、5龄健康褐飞虱。设置试验组与对照组各3个养虫笼，分别置于两个环境相同的温室中，温度为（27±2）℃，让褐飞虱适应一天。每个养虫笼喷施15 mL 8×1010孢子/mL金龟子绿僵菌悬浮剂稀释液，将绿僵菌稀释液用超低容量喷雾器均匀喷施于实验组养虫笼中的水稻茎、叶部和供试褐飞虱体表，取相同量的纯净水喷施于对照组养虫笼中。之后每天观察、统计各笼中供试褐飞虱数量共10 d，计算8×1010孢子/mL金龟子绿僵菌悬浮剂稀释液对褐飞虱的校正致死率。校正死亡率（%）＝（处理死亡率—对照死亡率）/（1—对照死亡率）×100。

1.3 金龟子绿僵菌悬浮剂生物活性田间检测

试验田采用统一的人工耕作管理方式，试验期间不使用其他农药，供试水稻采用柯博士有机稻，待有机稻生长至分蘖盛期开始对各试验田进行施药处理，所有试验采用常规容量喷雾。设置1个阳性对照组、1个处理组、1个空白对照组，每组0.2亩，重复3次。阳性对照田施以25%吡蚜酮可湿性粉剂（广州仟壹华琪生物技术有限公司），按25 g/亩的量用药；处理田施以8×1010孢子/mL金龟子绿僵菌悬浮剂，按50 mL/亩的量用药；空白对照田施以相应量的自来水。每一对照田、处理田均采用五点法于施药后3、7、10 d进行抽样调查，每个调查点抽取5丛水稻进行褐飞虱的数量统计，每块供试稻田共调查水稻75丛。调查时根据虫量多少采用直接计数法或盘拍法进行统计。统计褐飞虱数量后计算褐飞虱的相对防治效果，计算公式如下：相对防效（%）＝（空白对照区虫口数—药剂处理区虫口数）/空白对照区虫口数×100。

田间调查得到各试验田褐飞虱的数量后，根据褐飞虱发生程度分级标准对其为害程度进行分级（表1）。

表1 褐飞虱发生程度分级标准Table 1 The grading standards of brown planthopper degree of hazard

1.4 褐飞虱Vg基因表达量测定

用1.2的方法处理褐飞虱，分别于喷洒金龟子绿僵菌或纯净水后3、6、9 d取试验组与对照组水稻上存活的羽化1 d雌性褐飞虱，每个时间点各取15头褐飞虱，用液氮速冻后置于-86 ℃超低温冰箱中备用。

RNA提取采用Trizol试剂（Invitrogen公司），RNA的完整性通过1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，RNA浓度的测定在Nano Drop 2000核酸蛋白分析仪上进行，并通过OD260/OD280验证纯度。采用TaKaRa反转录试剂盒进行基因组DNA的消除及第一链cDNA的合成（TaKaRa Code：DRR047A）。

使用PCR多孔板按下列组分配置定量PCR反应体系（10 μL反应体系）：SYBR premix ExTaq，5 μL；cDNA 模板，1 μL；PCR Forward Primer（F），0.2 μL；PCR Reverse Primer（R），0.2 μL；ddH2O，3.6 μL；共10 μL。每个处理进行3次生物学重复，引物序列如表2所示，q-PCR反应程序如下：95 ℃预变性10 s；95 ℃变性5 s；58 ℃退火15 s；72 ℃延伸20 s；共40个循环。反应结束后确认q-PCR的扩增曲线和熔解曲线。定量数据由Light Cycler 480仪器自带的软件分析导出，导出数据为Ct值。Ct值表示每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。将数据导入Excel表，采用2-ΔΔCT法进行基因相对表达量分析，2-ΔΔCT＝2-[(CT待测组—CT待测18S)—(CT对照组—CT对照18S)]。

表2 定量PCR反应的引物Table 2 Primers of quantitative RT-PCR

1.5 褐飞虱生物测定

用1.2的方法处理褐飞虱，分别取喷洒金龟子绿僵菌或纯净水后第6 d水稻上存活的羽化第1 d雌性褐飞虱若干头，以每管1头的数量将它们分别接入产卵试管（直径3 cm，高20 cm）中，同时每支试管中接入1头健康的羽化第1 d雄性褐飞虱与其配对，把所有试管放在试管架上，置于温室中（28±2）℃，让褐飞虱自由交配。

交配后第4 d，观察产卵试管中雌性褐飞虱的存活情况。若雌性褐飞虱死亡，则认定该试管内的褐飞虱产卵无效，应舍弃；若雌性褐飞虱存活，则认定该试管内的褐飞虱产卵有效，将试管内的水稻根茎取出放在解剖镜下解剖、观察统计褐飞虱交配后0～4 d的产卵量，并放入一根新的水稻根茎让褐飞虱继续产卵。交配后第 8 d，继续观察产卵的雌性褐飞虱存活情况，若雌褐飞虱死亡，则解剖、观察水稻根茎统计褐飞虱交配后4～8 d的产卵量，且认定该褐飞虱8～16 d的产卵量为0粒；若雌褐飞虱存活，则将试管内的水稻根茎取出放在解剖镜下解剖、观察统计褐飞虱交配后4～8 d的产卵量，并放入一根新的水稻根茎让褐飞虱继续产卵。交配后第16 d，取出所剩试管中的水稻根茎，放在解剖镜下解剖、观察统计褐飞虱8～16 d的产卵量。已产卵的水稻根茎继续放置，一周后统计其孵化率。同时，统计褐飞虱的存活率。处理组、对照组各30组，共检测60组有效产卵量及孵化率。

1.6 褐飞虱体内海藻糖含量测定

按照1.2的方法处理褐飞虱，分别取喷洒金龟子绿僵菌或纯净水后存活的成虫第3 d和第6 d的雌性褐飞虱30头，冰浴PBS研磨；然后4 ℃、1000 g离心20 min，上清液采用杨萌萌等[24]的方法测定褐飞虱体内海藻糖的含量，3次重复。

1.7 数据统计与分析

数据为平均数±标准误，采用单因素方差分析（one-way ANOVA），t-test，q-test等方法检验平均数之间的差异显著性，所有步骤均在软件EXCEL 2007中进行，作图使用GraphPad Prism 6。

2 结果与分析

2.1 金龟子绿僵菌悬浮剂对褐飞虱的防治效果

用稀释500倍的金龟子绿僵菌悬浮剂喷洒的褐飞虱与空白处理的褐飞虱相比，随天数的增加校正死亡率呈上升趋势，并在第10 d时平均校正死亡率达到55.67%（图1），这说明在温室（28±2）℃中8×1010孢子/mL金龟子绿僵菌悬浮剂具生物活性，并且对褐飞虱的致死效果明显，该金龟子绿僵菌悬浮剂可用于后续试验。

图1 金龟子绿僵菌悬浮剂对褐飞虱的校正死亡率Fig.1 The corrected mortality rate of the M.anisopliae suspending agent to N.lugens in greenhouse experiment

2.2 田间条件下金龟子绿僵菌悬浮剂对褐飞虱的防治效果

随天数的增加药效对褐飞虱的致死效果越强，褐飞虱的存活数量呈明显的下降趋势（图 2）。在田间条件下检测施药后3、7、10 d对褐飞虱的防效，结果显示阳性对照喷洒吡蚜酮的防效分别为79.16%、89.13%和95.84%，喷洒8×1010孢子/mL金龟子绿僵菌悬浮剂对褐飞虱的防效分别为22.03%、27.75%和63.81%，施药后第7 d处理组、阳性对照组、空白对照组试验田中褐飞虱的数量都有一定量的下降，是因为施药后5～7 d当地持续降雨，冲走一定数量的褐飞虱，但不影响计算相对防效（图3）。

图2 不同处理后田间褐飞虱数量统计结果Fig.2 The number of N.lugens in field after spraying with different reagent

图3 金龟子绿僵菌悬浮剂对褐飞虱田间防控效果Fig.3 The relative control effects of the M.anisopliae suspending agent to N.lugens in field

2.3 金龟子绿僵菌对褐飞虱产卵量和卵孵化率的影响

喷洒8×1010孢子/mL金龟子绿僵菌悬浮剂6 d后开始检测羽化第1 d雌性褐飞虱的产卵量。结果显示，与对照组相比处理组的雌性褐飞虱产卵量和卵孵化率都有相应的下降（图4）。在3个检测时间段的卵孵化率对照组都在80%以上，而处理组的卵孵化率都在50%以下，卵孵化率显著降低（图4A）。在褐飞虱交配后的前4 d产卵量较少，处理组褐飞虱产卵量为对照组的60.35%；交配后的4～8 d处理组褐飞虱产卵量比对照组褐飞虱的少71.35粒，为正常褐飞虱产卵量的60.73%；交配后的8～16 d处理组产卵量为对照组的63.26%（图4B）。在检测的16 d内，处理组褐飞虱共产卵208.52粒，对照组共产卵338.33粒，金龟子绿僵菌的侵染使得褐飞虱平均少产129.81粒卵，产卵量下降了38.37%。

图4 金龟子绿僵菌悬浮剂处理后褐飞虱产卵量和卵孵化率测定Fig.4 The oviposition amount and hatching rate of N.lugens eggs after infection of M.anisopliae

2.4 金龟子绿僵菌对褐飞虱Vg表达量的影响

取金龟子绿僵菌侵染3 d后尚存活的羽化第1 d雌性褐飞虱进行Vg基因表达量的检测，结果显示此时雌性褐飞虱Vg的基因表达量极低，仅为对照组Vg基因表达量的32.26%；取金龟子绿僵菌侵染6 d后尚存活的成虫第1 d雌性褐飞虱，检测Vg基因表达量，与对照组相比Vg表达量为对照组的73.78%；而取金龟子绿僵菌侵染9 d后尚存活的成虫第1 d雌性褐飞虱，处理组Vg表达量与对照组接近，为对照组的93.33%（图5）。

图5 金龟子绿僵菌侵染不同时间褐飞虱Vg基因相对表达量Fig.5 The relative expression level of Vg in N.lugens after infection

2.5 金龟子绿僵菌对褐飞虱体内糖含量的影响

取金龟子绿僵菌侵染3 d尚存活的羽化第1 d雌性褐飞虱进行海藻糖含量检测，结果显示金龟子绿僵菌侵染褐飞虱体内海藻糖含量显著低于对照组，分别为0.25和0.56 nmol/μg，降低了55.4%。6 d后褐飞虱体内海藻糖含量有所上升，但含量仍显著低于对照组，分别为0.42和0.62 nmol/μg，降低了32.3%（图6）。

图6 金龟子绿僵菌侵染不同时间褐飞虱海藻糖含量检测Fig.6 The content level of trehalose in N.lugens at different treatment time after infection

3 讨论

本研究所使用的 8×1010孢子/mL金龟子绿僵菌制剂是由重庆大学近年研发而成的，在防治水稻害虫褐飞虱的初步试验上取得了良好效果[25]。结果显示在温室环境中，用8×1010孢子/mL金龟子绿僵菌悬浮剂喷洒褐飞虱，褐飞虱的校正死亡率逐天升高，并且在第10 d达到了最高，达55.67%（图1）。金少锋等[26]在田间施用多种不同株系的金龟子绿僵菌制剂防治稻飞虱，有两个菌株对稻飞虱的校正死亡率达到50%；使用浓度为1×108孢子/mL的真菌菌株IsariafumosoroseaPfu-5侵染紫背粉虱Aleurodicusrugioperculatus，对于卵和1龄若虫的平均致死率较高分别为44.03%和44.80%[27]；球孢白僵菌Beauveriabassiana的真菌分离物 MTCC 4495在浓度为 1×109孢子/mL下对菜青虫Pierisbrassicae的 3龄幼虫最高死亡率达到86.66%[28]。可见高浓度的昆虫病原真菌对害虫都有较高的致死效果，本试验也验证了这一点。在试验条件下确认了该金龟子绿僵菌的致病效果后，通过田间试验检验金龟子绿僵菌的野外适应能力。研究结果表明自然条件下金龟子绿僵菌的相对防效仍能保持在20%以上，并在第10 d相对防效达到了63.81%（图2），说明该浓度同样适用于野外环境防治褐飞虱，且效果明显。

通过产卵量的含量检测发现，感染金龟子绿僵菌的褐飞虱产卵量较正常情况下降了38.37%（图3），且卵的孵化率也在下降，这与Dimbi等[23]、Pablo等[29]、王宝辉等[30]的研究结果一致，害虫在感染绿僵菌后害虫的产卵水平都有明显的减少。但是并非所有昆虫的繁殖力和产卵功能都会受到绿僵菌的影响，如番茄潜麦蛾Tutaabsoluta在感染绿僵菌后只影响了它的生存并未影响它的繁殖[31]，而灰黑心结蚁Cardiocondylaobscurior的蚁后则在感染绿僵菌后导致繁殖投资加强从而提高了产卵率[32]。

检测8×1010孢子/mL金龟子绿僵菌悬浮剂处理后褐飞虱Vg的表达量，结果显示喷洒金龟子绿僵菌第3 d后羽化第1 d雌性褐飞虱的Vg相对表达量最低，喷洒金龟子绿僵菌第9 d后的雌性褐飞虱Vg相对表达量无明显差异。由前3个结果得知，褐飞虱繁殖力可能与其寿命相关，但繁殖力的降低不仅与成虫寿命的缩短有关，而且还可能与真菌感染而导致宿主卵子成熟所需的资源减少有关[33,34]。产卵是雌性昆虫生活中最耗能的事件之一，在卵子发生过程中，卵黄蛋白原（Vg）在脂肪体内合成，分泌到血淋巴中，然后通过卵黄蛋白原受体（VgR）介导的内吞作用掺入发育中的卵母细胞中[35,36]。除了Vg，还必须提供大量的碳水化合物以满足卵母细胞生长的能量需求[37]。本研究结果表明，感染了金龟子绿僵菌的褐飞虱体内海藻糖的含量显著降低，海藻糖是用于卵母细胞生长的主要循环糖[38]，已在东亚飞蝗Locustamigratoria中证实了海藻糖参与脂肪体中Vg的合成[39]。而绿僵菌能分泌海藻糖酶将昆虫血淋巴中的海藻糖分解为葡萄糖为自身提供碳源[40]。

综上所述，褐飞虱感染了金龟子绿僵菌后其体内海藻糖含量和Vg基因的表达量都显著降低，同时其产卵量、孵化率都显著低于对照。推测金龟子绿僵菌可能是通过消耗褐飞虱体内的海藻糖导致其产卵和孵化率都显著降低，同时因营养物质减少，导致其死亡率提高，其具体机理尚待进一步研究。