木霉共培养发酵对黄瓜枯萎病的防治效果

陈 凯，隋丽娜，赵忠娟，李 玲，扈进冬，李纪顺*

(1.齐鲁工业大学(山东省科学院)/山东省科学院生态研究所，济南 250103；2.齐鲁工业大学(山东省科学院)/生物工程学院，济南 250353)

黄瓜枯萎病（Cucumber Fusarium wilt）是由尖孢镰孢黄瓜专化型Fusariumoxysporumf.sp.cucumeriumOwen，FOC侵染引起的真菌病害，发病周期涉及黄瓜整个生长期，发病率通常为 10%～30%，严重年份可达50%；产量损失10%～50%，甚至绝收[1,2]。长期连作、土壤肥力下降、微生物菌群失衡是导致病害日渐严重的主要原因[3]。

黄瓜枯萎病的防治措施主要有抗性品种选育、作物间作、化学防治及生物防治等。抗性品种选育具有难度系数高、周期长、果实品质下降等缺陷[4,5]。作物间作虽可减少发病率，也存在田间管理困难、效果不理想等问题[6-8]。化学药剂在一定程度上能抑制黄瓜枯萎病的发生，马永强[9]研究表明，53.3 mg/g的噁霉灵·咯菌腈悬浮剂处理对黄瓜枯萎病防治效果为82.92%；Shi等[10]通过两年的田间试验，发现375 g/ha的阿维菌素与咯菌腈联合使用显著降低南方根结线虫Meloidogyneincognita和 FOC在土壤中的定殖数量，黄瓜增产达40.00%以上。长期使用化学药剂易导致病原菌产生抗药性、并带来环境污染、农药残留等问题。生物防治因其安全、友好、成本低、来源广等优点，成为当今植物病害防治的研究热点，防治黄瓜枯萎病的微生物种类主要有细菌、放线菌及木霉等。祝久香[11]利用多粘类芽胞杆菌PaenibacilluspolymyxaHX-140菌液灌根，对黄瓜枯萎病的田间防治效果达50.85%；李鸿坤等[12]研究发现，肉桂栗色链霉菌StreptomycescinnamocastaneusHJG-5粉剂对黄瓜枯萎病的盆栽防治效果达68.97%，显著高于多菌灵可湿性粉剂；Redda等[13]从内蒙古草原及森林土壤中分离到11株对黄瓜枯萎病的相对防治效果达100%的木霉菌株Trichodermaspp.。

黄瓜枯萎病的防治趋向低毒、低残留及绿色生态型发展，目前主要利用单一菌株进行生物防治，由于单一微生物及其制剂在应用中受外界环境影响较大，防效不够稳定。研究表明复合微生物比单一微生物对植物的促生和控制病害的效果更好，呈现增效作用[14,15]；Cong等[16]发现黑根霉Rhizopusnigricans与拟康氏木霉T.pseudokoningii混合发酵液对FOC的平板抑制率较单一菌株高60%以上，在盆栽试验中可提高黄瓜苯丙氨酸解氨酶PAL、超氧化物歧化酶SOD及过氧化物酶POD的活性，对黄瓜枯萎病的田间防治效果达76.5%。木霉是重要的植物病害生物防治菌，广泛分布在自然界中，在土壤和植物根际生物量中占有较大比例，木霉对黄瓜枯萎病的生防机制主要包括空间占位、降解病原菌细胞壁、产生抗生性代谢产物及诱导植物产生防御抗性等[17-19]。本实验室前期筛选到两株生防效果较好的木霉菌株：深绿木霉T.atrovirideHB20111和哈茨木霉T.harzianumTW21990[20,21]，本文拟探讨两株木霉共培养发酵对黄瓜种子发芽的影响及对黄瓜枯萎病的防治效果，为复合微生物农药的开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株与培养基

生防菌株为深绿木霉 HB20111（保藏编号 CGMCC No.16963）和哈茨木霉 TW21990（保藏编号CGMCC No.12864），病原真菌为尖孢镰孢黄瓜专化型FOC，均为本室分离保藏。

PDB培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、蒸馏水1 L。PDA培养基：1 L PDB培养基中加入10 g琼脂。发酵培养基：玉米粉20 g、黄豆粉10 g、K2HPO45 g、KH2PO42 g、蒸馏水1 L。

1.2 供试种子与试剂

黄瓜种子：品种为“津春 5号”，济南绿嘉园蔬菜种苗公司。对照药剂：25 g/L咯菌腈悬浮剂（Fludioxonil），先正达南通作物保护有限公司。DNA提取试剂盒：DNeasy PowerSoil土壤微生物DNA提取试剂盒，凯杰企业管理（上海）有限公司。

1.3 两株木霉的亲和性测定

菌株HB20111、TW21990纯化后，用φ＝5 mm的无菌打孔器打取菌落边缘的菌饼，接种在PDA平板的两端，25 ℃对峙培养5 d，观察两菌落在交接处的生长情况。

1.4 FOC孢子悬浮液的制备

将3块φ＝5 mm的FOC菌饼接入100 mL PDB培养基中，25 ℃、130 r/min振荡培养3 d，镜检产生大量分生孢子后，用8层无菌擦镜纸过滤掉菌丝，滤液经血球计数板计数后，用无菌水稀释至分生孢子含量分别为106、107cfu/mL的FOC孢子悬浮液。

1.5 共培养发酵液及发酵滤液的制备

菌株HB20111和TW21990在PDA平板上培养至产孢，用无菌水悬浮分生孢子，血球计数板计数后，制备成分生孢子含量为107cfu/mL的木霉孢子悬浮液。分别吸取50 μL的两种木霉孢子悬浮液接入100 mL发酵培养基中，25 ℃、130 r/min振荡培养。分别于24、32、40、48、56、64、72、80、88 h取样，收集不同时间的共培养发酵液；将共培养发酵液用无菌水分别梯度稀释50、100、250、500和1000倍，获得不同稀释倍数的共培养发酵液；将共培养发酵液于8000 r/min离心10 min，保留上清液，再用0.22 μm微孔滤膜过滤，获得发酵滤液。

1.6 共培养发酵液及发酵滤液浸种抑菌萌发试验

通过种子萌发试验筛选共培养发酵的最佳条件。挑选健康、大小一致的黄瓜种子，种子用5% NaClO消毒10 min，无菌水冲洗干净，用无菌滤纸吸干水分。先用1.5中不同处理的共培养发酵液或发酵滤液浸种1 h，取出种子，再置于1.4中的107cfu/mL FOC孢子悬浮液中浸种1 h，以无菌水为对照CK。处理完毕，将种子均匀放置在φ＝90 mm的双层湿滤纸平皿中，每皿20粒，3个重复。25 ℃保湿培养64 h，统计种子发芽率，测量根长，计算发芽抑制率和根长增长率。发芽率（%）＝发芽种子粒数/供试种子粒数×100，发芽抑制率（%）＝（对照组发芽率－处理组发芽率）/对照组发芽率×100，根长增长率（%）＝（处理组根长－对照组根长）/对照组根长×100。

1.7 木霉共培养发酵液对黄瓜枯萎病的温室效果试验

1.7.1 试验设计与方法 试验地点为山东省科学院东区温室内，试验期为2020年9月16日至2020年10月28日，试验设5个处理：CK、Fludioxonil、HB20111、TW21990、HB20111+TW21990。试验用土为健康大田土，过筛后等量分装一次性干净花盆（口径13 cm、高12 cm、800 g土/盆），每盆浇入1.4中的300 mL 106cfu/mL的 FOC孢子悬浮液，室温预培养 3 d。木霉单菌株 HB20111、TW21990及其共培养HB20111+TW21990分别于发酵培养基中25 ℃、130 r/min振荡培养72 h，发酵液500倍稀释后浸种1 h，药剂处理用100 μg/mL Fludioxonil浸种1 h，CK对照用清水浸种1 h。浸种完毕，将种子均匀播种在花盆中，种子上覆盖200 g土，每处理20粒种子，3个重复，随机区组排列，常规管理，待出苗后每盆定苗15株。

1.7.2 黄瓜幼苗及土样收集 试验结束，小心取出黄瓜幼苗根系，保留完整植株，抖掉根周围结构松散的土粒，收集与根结合紧密的根际土。土样放-20 ℃保存，幼苗放4 ℃保存。

1.7.3 病害调查 按照中华人民共和国农业行业标准《黄瓜主要病害抗病性鉴定技术规程第三部分：黄瓜抗枯萎病鉴定技术规程》，将黄瓜枯萎病病情级别划分为5个级别：0级，无症状；1级，子叶黄化，但未萎蔫；2级，子叶萎蔫；3级，子叶和真叶萎蔫或植株矮化；4级，枯死。并统计病情指数和防治效果。病情指数＝Σ（病级数×该病级植株数）/（最大病级数×植株总株数）×100，防治效果（%）＝（对照组病情指数－处理组病情指数）/对照组病情指数×100。

1.7.4 黄瓜幼苗鲜重调查 黄瓜幼苗冲洗干净，用滤纸吸干水分，称量各处理组幼苗鲜重，计算增重率。增重率（%）=（处理组幼苗鲜重－对照组幼苗鲜重）/对照组幼苗鲜重×100。

1.7.5 FOC荧光定量分析 利用DNeasy PowerSoil试剂盒提取土样DNA，以土样DNA为模板，FOC特异性引物 FOF1（5′-ACATACCACTTGTTGCCTCG-3′）和 FOR1（5′-CGCCAATCAATTTGAGGAACG-3′）[22]进行定量分析。qRT-PCR 扩增体系：2×SYBR Green qPCR Mix 10 μL、10 μmol/L 上下游引物各 1 μL、DNA模板 1 μL、ddH2O 补足至 20 μL。扩增程序：95 ℃预变性 10 min；95 ℃变性 30 s，57 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min，40 cycles；循环结束后，样品加热到95 ℃，立刻降至60 ℃保持5 s，然后每5 s提高0.5 ℃递增到95 ℃，建立熔解曲线。根据下列公式计算每克土样中的FOC拷贝数[23]。待测样本拷贝数（Copies/g）＝SQ×（6.02×1023×10-9×v）/（SD×660×m），其中SQ为待测样本浓度，v为提取土样DNA体积（μL），m为提取土样质量（g），SD为标准质粒碱基数。

1.8 数据统计与分析

运用SPSS 21.0统计软件对试验数据进行分析，采用Duncan氏新复极差法进行差异显著性检验，以不同小写字母表示各处理间在0.05水平上存在显著性差异。

2 结果与分析

2.1 两株木霉的亲和性测定

PDA平板上25 ℃对峙培养5 d，两菌株HB20111和TW21990亲和性较好，菌落间没有明显的拮抗带产生（图1），两菌落完全接触，菌落面积几乎各占50%，菌落交接处形成一条稍增厚的气生菌丝带，整个平板上几乎布满分生孢子。平板背面有色素差别，菌株TW21990产生黄色色素，菌株HB20111色素颜色较浅。

图1 深绿木霉HB20111和哈茨木霉TW21990对峙培养Fig.1 Confrontation culture between T.atroviride HB20111 and T.harzianum TW21990

2.2 木霉共培养发酵液及滤液浸种抑菌对黄瓜种子发芽的影响

2.2.1 不同稀释倍数发酵液对黄瓜种子发芽的影响 25 ℃、130 r/min培养88 h，不同稀释倍数的共培养发酵液对黄瓜种子发芽的影响结果见图2。稀释倍数不同，对黄瓜种子发芽率的影响不同，与对照CK相比，发酵液50、100倍稀释液显著抑制种子发芽（P＜0.05），发芽抑制率分别为17.24%、10.35%；而250、500、1000倍稀释液与对照CK无显著性差异。稀释倍数对黄瓜种子的根长有显著性影响（P＜0.05），在50～500倍稀释之间，根长与稀释倍数成正比，500倍稀释液处理根长增长率达108.53%，但1000倍稀释液处理则成下降趋势（根长增长率70.03%）。综合发芽率和根长结果，发酵液500倍稀释效果最好。

图2 不同稀释倍数木霉共培养发酵液对黄瓜种子发芽的影响Fig.2 Effect of cucumber seeds germination with Trichoderma co-cultured fermentation broth at different dilution ratio

2.2.2 不同时间发酵液对黄瓜种子发芽的影响 不同时间共培养发酵液500倍稀释液对黄瓜种子发芽的影响结果见图3。发酵时间对黄瓜种子的发芽率无显著影响，但对黄瓜根长有显著影响（P＜0.05）。在24～72 h之间，发酵时间越长，共培养发酵液对黄瓜种子根长的促生效果越好，发酵72 h根长增长率达108.53%；但在72～88 h之间，共培养发酵液对黄瓜种子的根长影响不显著。故最佳发酵时间为72 h。

图3 不同时间木霉共培养发酵液对黄瓜种子发芽的影响Fig.3 Effect of cucumber seeds germination with Trichoderma co-cultured fermentation broth at different time

2.2.3 发酵滤液对黄瓜种子发芽的影响 发酵72 h，500倍稀释的共培养发酵滤液对黄瓜种子发芽的影响结果见图 4。发酵滤液(FF)与发酵液(FB)对黄瓜种子发芽率无显著影响，但对黄瓜根长的促生效果差异显著（P＜0.05），根长增长率较发酵液降低21.19%。

图4 发酵滤液对黄瓜种子发芽的影响Fig.4 Effect of cucumber seeds germination with fermentation filtrate

依据以上结果，共培养发酵及浸种的最佳条件为：采用发酵培养基，25 ℃、130 r/min振荡培养72 h，发酵液500倍稀释处理。

2.3 木霉共培养发酵液对黄瓜枯萎病的温室防治效果

2.3.1 共培养发酵液对黄瓜根际土 FOC拷贝数的影响 温室条件下，不同处理黄瓜根际土 FOC拷贝数不同（表1）：4组处理与对照CK均存在显著差异（P＜0.05）；单菌株 HB20111、共培养HB20111+TW21990与药剂Fludioxonil也存在显著差异（P＜0.05）；共培养HB20111+TW21990黄瓜根际土FOC拷贝数最低，为0.88×109copies/g，较单菌株 HB20111、TW21990显著降低了黄瓜根际土FOC拷贝数（P＜0.05）。

2.3.2 共培养发酵液对黄瓜枯萎病病情指数的影响 不同处理黄瓜枯萎病病情指数不同（表1），4组处理与对照CK存在显著差异（P＜0.05）；单菌株HB20111、共培养HB20111+TW21990与药剂Fludioxonil存在显著差异（P＜0.05）；共培养HB20111+TW21990病情指数最低，与单菌株及其他处理间均存在显著差异（P＜0.05），对黄瓜枯萎病的防治效果达73.65%，较单菌株HB20111、TW21990分别提高了6.76%、9.46%。

2.3.3 共培养发酵液对黄瓜幼苗鲜重的影响 不同处理对黄瓜幼苗单株鲜重的影响不同（表 1）：4组处理与对照CK存在显著差异（P＜0.05）；药剂Fludioxonil、单菌株HB20111及TW21990间无显著差异；共培养HB20111+TW21990效果最好，与单菌株及其他处理间均存在显著差异（P＜0.05），幼苗鲜重增重率达35.64%，较单菌株HB20111、TW21990分别提高了11.54%、13.31%。

表1 木霉共培养发酵液对黄瓜枯萎病的温室防治效果Table 1 Control efficiency of Trichoderma co-cultured fermentation against cucumber Fusarium wilt in greenhouse

3 讨论

近年来，菌株联合作用防治植物病害的研究逐步引起大家的关注[24,25]。菌株HB20111与TW21990是本实验室前期筛选的综合生防效果较好的木霉菌株，菌株HB20111具有生长速率快、抑菌谱广、易产生分生孢子、水解酶活性较高的特点；菌株 TW21990具有生长速率快、抑菌谱广、易产生分生孢子、抗生性代谢产物活性较高的特点。两株木霉在 PDA平板上对峙培养时，无拮抗现象产生，具有较好的亲和性，为共培养发酵提供了有利条件。

通过浸种抑菌萌发试验发现，不同发酵时间、不同稀释倍数的共培养发酵液及发酵滤液对黄瓜种子的发芽率及根长影响不同：有的是促生作用，有的则为抑制作用。表明各处理中代谢产物成分及含量可能存在差异，高浓度时抑制种子发芽，低浓度时促进种子发芽。发酵滤液对黄瓜根长的促生效果不如发酵液处理（P＜0.05），表明发酵液中的木霉菌体在浸种抑菌萌发中也扮演重要角色，故选择共培养的最佳时间及使用浓度也是发挥其生防活性的重要因素。本文确定了2株木霉共培养最佳时间为72 h，浸种最佳稀释倍数为500倍。

温室条件下，共培养发酵液500倍稀释液浸种后，黄瓜根际土FOC拷贝数、病情指数及幼苗鲜重均与单菌株HB20111、TW21990存在显著差异（P＜0.05），显示两株木霉间协同增效作用明显，共培养发酵后，两株木霉可以进行优势和功能互补。也可能由于彼此间的生长竞争诱导分泌了更多的抗菌物质，且这些代谢产物也会对彼此的生长和代谢产生影响[26,27]。本研究还表明，各处理组根际土FOC拷贝数与病情指数成正比，与植株鲜重成反比。由于植株发病严重程度与植株根际土中病原菌的含量有关[28]，共培养发酵处理有效抑制了 FOC在黄瓜根际土中的定殖，故提高了对植物土传病害的防控作用，促进了作物的健康生长。

木霉是土壤微生物中对植物有益的一大类群，木霉与植物的互作主要通过根部定殖实现，但其对植物地上部分基因表达的影响却远大于根部，并可诱导植物产生系统抗性[29]。木霉在田间发挥作用受多种因素的影响，在植物病害的生物防治应用上还有不少问题需要解决。本文只利用共培养发酵液进行了温室防效测定，下一步拟通过液质分析等手段检测共培养发酵液中代谢产物的种类及含量，探究上调或下调的物质，以期发现新型抗生性代谢产物或新的抗生机制。