钩状木霉菌的生物学特性及对腐皮镰刀菌的抑菌机理研究

胡 娴，陈宸彤，谢杨鋆，何 珊，史红安，张志林，白翠华*

（1.华南农业大学资源环境学院，广州 510630；2.湖北工程学院特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室，孝感 432000）

木霉菌Trichodermaspp.，世界性分布的真菌，主要分布于土壤、腐烂木材和根围中[1,2]，具有适应强、代谢物质多样、寄主广泛等特点[3]，对植物病原真菌拮抗性强，以及较高的促进植物生长和防御等作用，在土壤修复、病害防治、促进植物生长等方面得到广泛应用[4-7]。由于化学农药在植物病害防治中的过度使用，引发人畜中毒、高残留、环境污染等问题，而木霉菌具有来源广泛、无污染等特点[8]，已成为植物病害防治中最具开发潜力的防治方法之一。

自Weindling[9]发现木霉菌寄生于病原微生物后，研究发现木霉菌能通过营养和空间的竞争、重寄生和代谢过程中产生化学物质抑制病原菌的生长，在植物病害防治方面越来越被重视[10]。木霉菌对病原菌的拮抗作用易受光照、温度、pH值、微量元素和营养物质等因子的影响[11-13]。钩状木霉菌Trichodermahamatum被广泛应用于植物病害的防治中，其代谢产物对多种植物病害具有良好的防治效果[14]，而目前对钩状木霉菌的生物学特性、发酵液活性成分的提取和抑菌机理研究较少。本研究从兰花根部分离出的一株木霉菌，对腐皮镰刀菌具有良好的拮抗作用，并进一步研究了该菌株发酵液不同有机溶剂提取物对腐皮镰刀菌抑菌效果和作用机理，同时还系统地探讨了生长因子对该木霉菌菌落生长的影响，以期为其在生产上更好应用于腐皮镰刀菌引起的土传病害防治奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试病原菌：腐皮镰刀菌Fusariumsolani为湖北工程学院特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室保存菌种。

供试培养基：马铃薯葡萄糖培养基（PDA）、查氏培养基（Gzapek）、玉米粉培养基（MSA）、胡萝卜蔗糖培养基（CSA）和PDA+维生素B (VB)培养基。

供试药品：引物和PCR扩增试剂盒生工生物工程（上海）股份有限公司，升汞、半乳糖、蔗糖、乳糖、肌醇、甘露醇、淀粉、几丁质、甘氨酸、赖氨酸、蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、正己烷、乙酸乙酯、正丁醇、氯仿、乙醚、乙酸丁酯、乙二酸二乙醚和维生素B (VB)等均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。

供试仪器：SPX-25085H-II生化培养箱（上海新苗医疗器械制造有限公司）；PowerPac Basic电泳仪(上海珂淮仪器有限公司)；ND2000C微量蛋白质核酸分光光度计（Thermo，美国）；Gray-96G PCR仪（上海山富科学仪器有限公司）；Sigma3K15高速冷冻台式离心机（北京五洲东方科技发展有限公司）；THZ-82B气浴恒温振荡器（常州市亿能实验仪器厂）；Ti-S倒置荧光显微镜（Nikon，日本）。

1.2 试验方法

1.2.1 木霉菌的采集、分离与纯化 木霉菌株样品采自湖北大悟兰花植株样品，取新鲜的兰花根部，用无菌水冲洗干净后，依据温晨阳等[15]内生菌分离方法略做修改，在PDA培养基平板上对兰花根部组织进行分离获得菌种，待菌长出后，取边缘少许菌丝接种于PDA培养基上进行纯化，重复3次后，将获得的菌株命名为LAN2B-1。

1.2.2 菌株LAN2B-1的鉴定 挑少许纯化后的菌丝接种于均匀涂布PDA培养基的载玻片上，置25 ℃恒温培养箱中培养1 d，利用光学显微镜观察菌丝和孢子形态，并结合培养性状及其相关真菌分类资料进行形态学鉴定。

将分离纯化菌株LAN2B-1菌丝收集研磨后，采用SDS法[16]提取DNA，利用ITS4和ITS5进行PCR扩增菌株ITS序列，真菌通用引物序列为5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′和5′-GGAAGTAAAAGTCGT AACAA-3′，反应液引物ITS4和ITS5各0.5 μL、2×PCR master 25 μL（PCR扩增体系），供试菌株的DNA模板1 μL，ddH2O 23 μL，反应总体系为50 μL。PCR扩增条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s；52 ℃退火45 s；72 ℃延伸1 min，共设30个循环；后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存，扩增产物送交上海生工进行测序，测序结果与GenBank中已知序列比对，确定分离菌株分类地位，并构建系统进化树进行分子生物学鉴定。

1.2.3 菌株LAN2B-1生物学特性 将直径为6 mm的新鲜菌饼分别接种于马铃薯葡萄糖培养基（PDA）、查氏培养基（Gzapek）、玉米粉培养基（MSA）、胡萝卜蔗糖培养基（CSA）和PDA+VB培养基中，置25 ℃条件下培养，每个处理3次重复。培养48 h后采用十字交叉法测量菌落直径。

将等量的甘氨酸、赖氨酸、蛋白胨、酵母粉、牛肉膏加入培养基中配成不同氮源的 PDA培养基，以PDA培养基为对照，将直径为6 mm的新鲜菌饼接种于PDA培养基平板上，置25 ℃条件下培养，每个处理3次重复。培养48 h后采用十字交叉法测量菌落直径。

将等量半乳糖、蔗糖、乳糖、肌醇、甘露醇、淀粉、几丁质替换 PDA培养基中葡萄糖，配成不同碳源的PDA培养基，以无糖做对照，将直径为6 mm的新鲜菌饼接种于PDA培养基平板上，置25 ℃条件下培养，每个处理3次重复。培养48 h后采用十字交叉法测量菌落直径。

1.2.4 不同温度试验 将直径为6 mm的新鲜菌饼接种于PDA培养基平板上，分别置15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃恒温条件下培养，每个处理3次重复。培养48 h后采用十字交叉法测量菌落直径。

用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl将PDA培养基的pH值分别调节为3、4、5、6、7、8、9、10、11后，将直径为6 mm的新鲜菌饼分别接种于不同pH值的PDA培养基平板上，置25 ℃条件下培养，每个处理3次重复。培养48 h后采用十字交叉法测量菌落直径。

将直径为6 mm的新鲜菌饼接种于PDA培养基平板上，分别在连续光照、连续黑暗、光照黑暗交替（12D:12L）的3种光照条件下25 ℃培养，每个处理3次重复。培养48 h后采用十字交叉法测量菌落直径。

1.2.5 菌株LAN2B-1代谢产物对腐皮镰刀菌的抑制作用 采用玻璃纸法，将灭菌的玻璃纸平铺于PDA培养基上后，将直径为6 mm的新鲜菌株LAN2B-1菌饼接种于玻璃纸上，待菌株LAN2B-1菌丝长满平板前，揭去玻璃纸，接种直径为6 mm腐皮镰刀菌新鲜菌块，以未接菌株LAN2B-1菌饼的PDA培养基为空白对照，3次重复，25 ℃条件下培养7 d后测菌落直径，计算抑制率，抑制率（%）＝（对照菌落直径－处理菌落直径）/（对照菌落直径－菌饼直径）×100。

1.2.6 菌株LAN2B-1发酵液提取物对腐皮镰刀菌的抑菌作用 在300 mL PDA液体培养基中加入6个菌株LAN2B-1菌饼（直径为6 mm）后，于25 ℃、180 r/min恒温振荡培养箱中培养7 d，过滤后得到发酵液，以正己烷、乙酸乙酯、正丁醇、氯仿、乙醚、乙酸丁酯、乙二酸二乙醚为萃取剂，按发酵液:萃取剂（V/V）=1:3常温下萃取，静至24 h后分液去除无机相，减压旋转蒸发去除有机相[15]，重复3～4次后，合并萃取后的有机相减压浓缩，200 mL发酵液提取物加入10 mL甲醇溶解，取5 mL甲醇溶解液加入100 mL PDA液体培养基中摇匀，制成平板，接种直径为6 mm腐皮镰刀菌新鲜菌块，以每100 mL PDA液体培养基中加入5 mL甲醇做空白对照，计算抑菌率。

1.2.7 菌株LAN2B-1发酵液对腐皮镰刀菌菌丝可溶性蛋白、还原糖含量的影响 分别采用考马斯亮蓝法[17]测定菌丝体内可溶性蛋白含量和DNS法[17]测定菌丝体内还原糖含量。

1.3 数据统计与分析

文中数据均采用SPSS 22.0软件中单因素方差分析，差异显著性分析采用Duncan’s法，P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 菌株LAN2B-1的形态观察

木霉菌株LAN2B-1在PDA培养基上培养36 h后菌落呈白色绒状，48 h后菌落开始形成绿色分生孢子，产孢区平展，呈同心轮纹状排列，产孢簇表面为颗粒状或粉状，菌株具有微弱土腥味，产孢簇初为水绿色，后转为黑绿色，无色素分泌（图1A，B）。菌丝呈白色透明状，木霉瓶梗短、基部细长、中间膨大，顶部变细，常 2～5个轮生；孢子梗丛束稀疏，环状排列，主分枝呈树状分枝，主轴直，偶有弯曲，次级分枝较多，常2～3个一组，成直角伸出；分生孢子呈球形，倒卵形或短椭圆形，大小为（2.1～3.2）μm×（2.3～4.0）μm（图1C）。依据木霉菌菌株LAN2B-1的形态特征和培养特性，初步推断其为钩状木霉菌。

图1 菌株LAN2B-1的形态结构Fig.1 Morphology of LAN2B-1

2.2 菌株LAN2B-1分子生物学鉴定

利用真菌ITS4/ITS5对菌株LAN2B-1 16S rDNA基因进行扩增，得到600 bp的片段，将其与已在NCBI上登记的19种木霉菌的ITS序列进行比对（图2），发现LAN2B-1菌株与钩状木霉菌的相似性为99%，构建系统发育树发现菌株LAN2B-1与钩状木霉菌位Z48816.1位于系统发育树同一支，聚为一类，结合菌落形态特征以及分子生物学鉴定该菌株为钩状木霉菌。

图2 菌株LAN2B-1 16S rDNA系统发育树构建Fig.2 Construction of phylogenetic tree of strain 16S rDNA of LAN2B-1

2.3 钩状木霉菌LAN2B-1生物学特性

不同培养基对菌落生长的影响：在 PDA、查氏培养基（Gzapek）、玉米粉培养基（MSA）、胡萝卜蔗糖培养基（CSA）和 PDA+VB培养基上菌落均能正常生长。在 PDA培养基上菌落生长最快，其次为PDA+VB，生长48 h后显著高于其他三种培养基（图3A）。

不同氮源对菌落生长的影响：以甘氨酸作为氮源的 PDA培养基上菌落生长优于对照，但不存在显著差异，其次为蛋白胨、酵母粉、牛肉膏作为氮源的PDA培养基（图3B）。

不同碳源对菌落生长的影响：菌落在以甘露醇和肌醇作为碳源的 PDA培养基上生长最快，菌落在以蔗糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖作为碳源的 PDA培养基上生长速度与对照培养无显著差异，而菌落在以几丁质和淀粉作为碳源的PDA培养基明上的菌落直径显著低于对照（图3C）。

不同pH值对菌落生长的影响：在pH为3～11之间菌落均能正常生长，最适生长pH为4～5，随着pH值的增大，菌落直径呈下降趋势（图3D）。

不同温度对菌落生长的影响：25 ℃～30 ℃为菌落最佳生长温度，菌落生长速率最快，15 ℃条件下菌落生长较为缓慢，35 ℃条件下菌落不能正常生长（图3E）。

不同光照处理对菌落生长的影响：在连续暗条件下菌落生长速度最快，达到61.06%，显著高于全光照和光照黑暗交替条件下菌落生长速度（图3F）。

图3 钩状木霉菌菌株LAN2B-1的生物学特性Fig.3 Biological characteristics of T.hamatum LAN2B-1

2.4 钩状木霉菌LAN2B-1代谢产物对腐皮镰刀菌抑制作用

利用玻璃纸法检测了钩状木霉菌 LAN2B-1代谢产物对腐皮镰刀菌的抑制作用结果表明，钩状木霉菌LAN2B-1代谢产物对腐皮镰刀菌的抑制率为45.59%（图4）。

图4 钩状木霉菌菌株LAN2B-1对腐皮镰刀菌的拮抗作用Fig.4 Antagonistic effect of T.hamatum LAN2B-1 against F.solani

2.5 钩状木霉菌LAN2B-1发酵液对腐皮镰刀菌抑菌活性

比较了7种钩状木霉菌LAN2B-1发酵液有机溶剂提取物对腐皮镰刀菌的抑菌效果，其中氯仿发酵液提取物抑菌率最高，为59.38%，其次分别为乙二酸二乙醚、乙醚和乙酸丁酯发酵液提取物，抑菌率分别为52.68%、49.26%和42.52%，而正己烷、正丁醇和乙酸乙酯发酵液提取物对腐皮镰刀菌均无抑菌活性（表1）。

表1 钩状木霉菌菌株LAN2B-1发酵液不同萃取剂提取物对腐皮镰刀菌的抑制作用Table 1 The inhibitory rate of active substance from fermentation broth of T.hamatum LAN2B-1 by different extractants on F.solani

2.6 腐皮镰刀菌菌丝可溶性蛋白、还原糖含量测定

经钩状木霉菌发酵液处理后，腐皮镰刀菌菌丝体内可溶性蛋白含量均显著降低，且含量随木霉菌发酵液浓度的升高而下降，镰刀菌菌丝体内还原糖含量随木霉菌发酵液浓度的升高而下降；当钩状木霉菌发酵液浓度为400 μg/mL时，可溶性蛋白含量最低为0.0215 mg/g，还原糖含量最低为0.1605 mg/g，均显著低于对照处理（表2）。

表2 钩状木霉菌菌株LAN2B-1发酵液对腐皮镰刀菌菌丝可溶性蛋白、还原糖含量的影响Table 2 Effect of fermentation broth of T.hamatum LAN2B-1 on soluble protein and reducing sugar content of F.solani

3 讨论

木霉菌为应用广泛的生防菌之一，具有土壤修复[6]、解磷[18,19]、促进植物生长[20]和防治植物病害[21]等作用，可作为高效、经济、环保的原材料和富有成果的资源应用于工业和农业生产中[22,23]。本研究确定菌株LAN2B-1为钩状木霉菌，在pH值为4～5、温度25 ℃～30 ℃时菌落生长最佳，这与王晖等[24]报道钩状木霉菌Th12最适发酵条件为25 ℃、起始pH值6的结论基本相似。同时，本研究还发现钩状木霉菌具有较强的酸碱和氮源适应性的特点，表明该菌株具有很强的环境适应能力，能用于较多逆境条件下腐皮镰刀菌引起的土传病害的防治。

目前，木霉菌已广泛应用于镰刀菌的防治中，如张丽荣等[25]分离得到22株木霉，其中6株木霉菌对西瓜枯萎病菌Fusariumoxysporumf.sp.niveum抑菌率均大于76.92%。本研究发现钩状木霉菌代谢产物对腐皮镰刀菌具有一定的抑制作用，抑菌率为45.59%，发酵液氯仿提取物对腐皮镰刀菌的抑菌率为59.38%。研究发现，木霉菌代谢产物抑菌活性成分主要为酸类和酮类[26]；魏琳等[27]采用系统溶剂法对哈茨木霉TrichodermaharzianumTUV-13分生孢子发酵液提取时，发现氯仿是木霉菌水稻体外模拟培养物有效物质提取的最适溶剂，其提取物主要包含烷烃、有机酸类、酯类、酮类、类固醇类等有机化合物。因此，推测氯仿提取物中可能含有大量酸类和酮类可增加其抑菌活性，但有机物对钩状木霉菌发酵液活性成分提取的影响有待于进一步的研究。

蛋白质是菌丝细胞维持正常生命活动所需的基本物质，而还原糖是菌丝细胞正常生理代谢所需的能量来源和物质基础[28,29]，菌丝体蛋白质和还原糖含量的减少，会使菌丝生长受到影响[17]。钩状木霉菌株发酵液处理后的腐皮镰刀菌细胞内可溶性蛋白和还原糖的含量均随钩状木霉发酵液含量的增加而降低，表明钩状木霉菌发酵液能促进镰刀菌菌体细胞内可溶性蛋白流失和还原糖的分解，扰乱菌体的生理代谢，从而导致菌体死亡。

不同的环境因子对木霉菌抑菌效果影响较大，因此在生产上利用木霉菌防治土传病害时，需要对微生物生长环境进行评估，以便选择适当的菌种，确保在病害防治过程中取得更好的防治效果。本研究探索了钩状木霉菌生物学特性和对腐皮镰刀菌的抑菌机理，发现钩状木霉菌具有很强的环境适应能力，且对腐皮镰刀菌引起土传病害具有良好的防效，为农业可持续发展及优良微生物菌株资源利用提供了参考价值。