基于网络药理学探讨补阳还五汤治疗冠心病的作用机制*

张剑剑，闫奎坡，冯 娟，郭雨晴，孙彦琴 ，刘 刚

(1河南中医药大学，河南 郑州 450046；2河南中医药大学第一附属医院心脏中心，河南 郑州 450000)

冠心病(coronary heart disease,CHD)是指由于冠状动脉粥样硬化使管腔狭窄或闭塞导致心肌缺血、缺氧或坏死而引发的心脏病。随着老龄化进程的加剧, 我国冠心病的发病和病死人数将持续增加[1]。冠心病属中医学“胸痹”“心痛”“真心痛”范畴，多与瘀血、痰饮、寒邪、体虚、劳累、情志等致病因素有关。补阳还五汤是出自清代医家王清任所著《医林改错》的经典名方，具有补气活血通脉的功效，治疗冠心病的疗效已得到临床的认可[2-4]。现代药理学研究证明，补阳还五汤可调节斑块内细胞自噬水平，减少炎症因子的释放，降低动脉硬化斑块面积，降低血脂水平，从而达到抗动脉粥样硬化的作用[5]；可促进新生血管的生成,改善血流供应,抑制细胞凋亡,保护受损心肌[6]。随着科技的发展，针对中医药的现代化研究不断出现，本研究尝试利用中药系统药理学分析平台，通过网络药理学构建多靶点蛋白与基因的互作关系，探讨补阳还五汤治疗冠心病的作用机制，探索补阳还五汤的现代科学内涵，以期为该方在临床的合理应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 补阳还五汤药物活性成分及靶点的获取与收集

利用中药系统药理数据库和分析平台(TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php)对补阳还五汤中的7味中药的活性成分、靶点分别进行检索。检索关键词分别是 “黄芪”“当归尾”“赤芍”“地龙(去土)”“川芎”“红花”“桃仁”标准中文名称或拉丁文名称，设定口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18为筛选条件，收集符合条件的中药活性成分。收集到主要活性成分的作用靶点后，利用Uniprot 数据库(https://uniprot.org/)得到对应靶点的基因号及标准化名称。

1.2 冠心病疾病靶点的获取

设定关键词为“coronary heart disease”，使用GeneCards(https://www.genecards.org/ )和OMIM(https://www.omim.org/)数据库及文献查阅，对冠心病的相关疾病靶点进行检索，收集并整合数据。

1.3 筛选药物与疾病共同靶点并构建互作网络

使用R语言软件获得药物与冠心病疾病的共同靶点，绘制出维恩图(Venn图)。将得到的共有靶点信息输入String平台(https:// string-db.org/)，将物种定义为“homo sapiens”， 选择置信度>0.90，隐藏离散节点，构建富集分析与蛋白质互作用网络(PPI)网络图，分别保存PNG、TSV格式。利用R软件对靶点的节点进行统计分析并呈现可视化。

1.4 药物-活性成分-靶点-疾病网络图构建

使用 Cytoscape 3.8.0 软件(http://www.cytoscape.org/)构建药物、活性成分、靶点、疾病互作网络图，网络图中的节点(node)分别代表活性成分、药物、疾病、靶点，边(edge)代表不同节点之间的相互联系。

1.5 GO分析和 KEGG 通路富集分析

应用R软件对在Bioconductor(http://www.bioconductor.org/)在线数据库得到的药物与疾病共同靶标基因进行GO分析和KEGG通路富集分析。以P<0.05、q<0.05作为条件进行过滤，将前20条基因生物过程和信号通路通过高级气泡图和通路图进行可视化分析。

2 结 果

2.1 补阳还五汤的主要活性成分及作用靶点

使用 TCMSP 数据库分别检索黄芪、当归尾、赤芍、地龙(去土)、川芎、红花、桃仁的活性成分，以药动学参数OB≥30%和 DL≥0.18为筛选条件，用当归尾代替当归，去除地龙，筛选后初步得到活性成分结果为黄芪20个，赤芍29个，川芎7个，当归2个，红花22个，桃仁23个。由于筛选条件的限制，许多含有广泛药理学作用的成分未被选中，比如阿魏酸、芍药苷、黄芪甲苷、红花黄色素等。为了提高预测的全面性、可靠性，根据文献查询的方式增加相关活性成分黄芪12个、赤芍4个、川芎1个、当归1个、红花2个，剔除重复后共得到111个活性成分。通过TCMSP数据平台检索到各药物的作用靶点共1 489个。对主要活性成分对应的作用靶点进行整理，并通过 UniProt数据库将其基因名称统一转换为标准化基因名称，共获得药物作用靶点基因980个，删除重复，共获得231个药物作用靶点基因。补阳还五汤主要活性成分及作用靶点基本信息见表1。

表1 补阳还五汤主要活性成分及作用靶点基本信息

续表1 补阳还五汤主要活性成分及作用靶点基本信息

续表1 补阳还五汤主要活性成分及作用靶点基本信息

2.2 疾病靶点的筛选

通过GeneCards、OMIM数据库获得冠心病潜在疾病作用靶点共7 557个，将得到的靶蛋白信息通过 UniProt数据库统一转换为人源(homo sapiens)的标准化基因名。

2.3 药物与疾病共同靶基因及PPI网络构建

将筛选得到的231个药物靶基因、7 557个疾病靶基因，应用联川生物平台Bio-Venn(http://www.biovenn.nl/index.php)绘制Venn图(见图1)，获得共同作用靶基因192个(见表2)。将192个共同靶基因在 STRING 平台进行 PPI 网络分析，去除游离节点，并进行可视化处理(见图2)。使用R软件对出现频次较高的前20个节点进行统计并绘制柱状图(见图3)。可以看到AKT1、JUN、MAP激酶(MAPK1、MAPK8、MAPK14)、RELA、APP、白细胞介素(IL-6、CXCL8)、FOS、CTNNB1、ESR1、表皮生长因子受体(EGFR)、PRKCA、血管内皮生长因子A(VEGFA)等关联程度较高，是整个网络中最重要的基因蛋白。

表2 药物与疾病共同作用靶基因

续表2 药物与疾病共同作用靶基因

2.4 药物-活性成分-靶点-疾病网络图

使用cytoscape3.8.0 构建药物-活性成分-靶点-疾病互作网络图(见图4)。共有303个节点(疾病1 个，药物 6个，有效活性成分65个，基因靶点231个)和 1 105条连线。结果显示，HH16 quercetin(槲皮素)、HH14 Luteolin(木犀草素)、HQ5 isorhamnetin(异鼠李素)、CS5、DG1、HH11和TR16 中均含有的β-谷甾醇(beta-sitosterol)、川芎嗪 (CX5 tetramethylpyrazine)、芍药苷(CS3 paeoniflorin)等化合物连线较为密集，可能是补阳还五汤治疗冠心病发挥疗效的核心活性成分。

2.5 GO基因生物过程和KEGG信号通路富集分析

应用R软件进行GO富集分析，共得到172条生物过程，将P值最小的前20条生物过程绘制成柱状图、气泡图(见图5、图6)。从图中可以看出，其中核激素受体结合(nuclear hormone receptor binding)、配体激活转录因子活性 (ligand-activated transcription factor activity)、DNA结合转录激活物活性(DNA-binding transcription activator activity)、RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合(RNA polymerase II-specific DNA-binding transcription factor binding)、血红素结合(heme binding)、四吡咯结合(tetrapyrrole binding)、细胞因子受体结合(oxidoreductase activity, acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen、cytokine receptor binding)、肽结合(peptide binding)、细胞因子活性(cytokine activity)、protein heterodimerization activity等生物过程中靶基因较为集中。

通过R软件进行KEGG分析，设置P<0.05、q<0.05进行筛选，共得到33条信号通路，排除广泛通路，选择P值最小的前20 条信号通路展示信息，同时绘制高清柱状图(见图7)、气泡图(见图8)。从图中可以看出，靶基因主要分布在Fluid shear stress and atherosclerosis、PI3K-Akt signaling pathway、Human cytomegalovirus infection、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、Hepatitis B、Prostate cancer、Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection、IL-17 signaling pathway、Hepatitis C、TNF signaling pathway、Hepatocellular carcinoma等信号通路上。

3 讨 论

补阳还五汤由黄芪、赤芍、川芎、当归尾、红花、桃仁、地龙7味中药组成。方中黄芪味甘性温，大补元气，取其气旺行血祛瘀之意，为君药；当归尾味甘、辛，性温，活血祛瘀又不伤血，为臣药；川芎、赤芍、桃仁、红花助归尾活血祛瘀血之效，为佐药；地龙味咸性寒，通经活络，为使药。诸药合用，合奏补气活血通脉之效，适用于气虚、血瘀所致胸痹 。

本研究基于网络药理学，并通过整合生物信息学方法，对补阳还五汤治疗冠心病的作用机制进行了初步探析。结果发现，共收集药物活性成分111个，药物作用靶点231个，与冠心病共同靶基因192个，其中核心蛋白有AKT1、JUN、MAP激酶(MAPK1、MAPK8、MAPK14)、RELA、APP、白细胞介素(IL-6、CXCL8)、FOS、CTNNB1、ESR1、EGFR、PRKCA、VEGFA。AKT是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶, 是PI3K/AKT信号通路上的重要因子，可调节细胞的增殖、凋亡、分化，以及迁移等，参与的PI3K/AKT信号通路是肿瘤、冠心病、代谢紊乱等多种疾病的病理形成过程[7]。JUN属于核转录激活因子(AP-1)，广泛参与细胞增殖、凋亡、存活等[8]， AP-1通过调节细胞内信号通路可对动脉粥样硬化的形成及进展过程进行调控,也能在维持动脉粥样硬化斑块稳定性方面发挥作用[9]。MAPK1因遗传多态性可能影响冠心病的血脂代谢和凝血功能,还可能参与冠心病的炎性反应[10]。MAPK信号通路参与炎症反应，促进了动脉粥样硬化的发生和发展[11]。IL-6作为多功能的炎症细胞因子，在心肌缺血再灌注损伤发生发展过程中具有双重作用, 既能损伤心肌又能限制缺血面积扩大[12]。EGFR是一种受体型蛋白酪氨酸激酶,广泛表达于包括心脏和血管的正常组织,是调控许多基本的细胞生物过程如分化、增殖、迁移等的重要因子，过表达或过度刺激可以导致细胞生长紊乱和组织重构[13]。VEGF可促进血管生成,在动物的动脉损伤模型及冠状动脉结扎模型中, 应用VEGF基因转导可观察到VEGF成功表达, 并可促进血管形成, 增加侧支循环, 有效抑制损伤血管的再狭窄[14]。

由“药物-活性成分-靶点-疾病网络图”可见，补阳还五汤治疗冠心病涉及的关键有效成分有槲皮素、木犀草素、异鼠李素、β-谷甾醇、川芎嗪、芍药苷等化合物。槲皮素可能通过调节介导的氧化应激、抑制清道夫受体表达，减少氧化低密度脂蛋白吸收、影响自噬相关蛋白的表达来发挥保护高脂膳食诱导ApoE KO小鼠动脉粥样硬化的作用；槲皮素可能通过上调PI3K/AKT/mTOR通路降低脓毒症小鼠心肌组织炎症和氧化应激反应,从而减轻心肌损伤[15-16]。木犀草素是一种天然黄酮类化合物，通过抑制NF-κB信号通路抑制炎症、抑制氧化应激发挥抗动脉粥样硬化作用，通过激活PI3K/Akt信号通路、抑制TLR-4/NF-κB信号通路发挥心肌缺血再灌注损伤保护作用[17]。异鼠李素通过调控H9c2心肌细胞自噬及凋亡通路蛋白表达，提高细胞存活率，减轻心肌损伤[18]；异鼠李素能抗动脉粥样硬化、抗血栓、抗高血压、降血脂、抑制心肌肥大等，在心血管系统方面具有重要作用[19]。β-谷甾醇具有降低胆固醇、甘油三酯及脂肪酸的作用[20]，并且具有心血管保护作用[21]，动物实验证实其可能参与氧化应激、炎症反应和凋亡途径抑制大鼠心肌缺血再灌注损伤[22]。川芎嗪是从中药川芎提取的主要单体成分之一，具有改善心肌缺氧状况、保护心肌细胞及心肌缺血再灌注损伤等作用[23]。芍药苷对垂体后叶素致大鼠实验性心肌缺血有显著的预防性保护作用,对结扎犬冠状动脉缺血模型有明显的抗心肌缺血作用[24]。

GO基因生物过程显示,补阳还五汤治疗冠心病与其靶基因参与的nuclear hormone receptor binding、ligand-activated transcription factor activity、DNA-binding transcription activator activity、RNA polymerase II-specific DNA-binding transcription factor binding、heme binding、tetrapyrrole binding、oxidoreductase activity, acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen、cytokine receptor binding、peptide binding、cytokine activity、protein heterodimerization activity关系密切。KEGG通路富集分析结果显示，补阳还五汤治疗冠心病主要涉及Fluid shear stress and atherosclerosis、PI3K-Akt signaling pathway、Human cytomegalovirus infection、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、Hepatitis B、Prostate cancer、Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection、IL-17 signaling pathway、Hepatitis C、TNF signaling pathway、Hepatocellular carcinoma等信号通路。有研究表明，在生理状态下，剪切力可通过维持内皮细胞稳态发挥抗动脉粥样硬化作用，病理剪切力则会导致内皮功能障碍，促进动脉粥样硬化进展[25]。心肌细胞Akt、p-Akt和Bcl-2蛋白的下调，Bax和Caspase-3蛋白的上调，可以激活PI3K/Akt通路，促进细胞凋亡，此过程可能是冠心病痰瘀互结证的发病机制之一[26]。也有大量研究证实，PI3K/Akt是细胞内非常重要的信号转导途径，在细胞的生长、增殖、凋亡、血管生成、自噬等方面起着重要作用[27-29]。以上均说明补阳还五汤可能通过干预细胞凋亡、脂代谢、炎症反应、免疫调节等发挥治疗冠心病的作用。

本研究基于网络药理学，初步探讨了补阳还五汤治疗冠心病的作用机制，结果涉及众多成分、靶点，参与多条生物进程及信号通路。本次研究基本与以往研究相符合，基于计算机数据库得出的结论，需要更多动物实验进行佐证，希望能够为今后的进一步相关研究提供依据和思路。