蠲痹化湿汤联合西药治疗类风湿关节炎的疗效及对基质金属蛋白酶、DNA甲基转移酶和趋化因子的影响*

张 超，梁 舒，郭占非，许振丹，左淑飞，范文强，吴 洁，卢俊永

(1.新乡市中心医院风湿免疫科，河南 新乡 453000； 2.新乡市中心医院中医科，河南 新乡 453000)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一类以炎性滑膜炎表现居多的慢性病变，其病因至今尚未明确，患病后表现为手、足部等关节不同程度的炎症，可累及其他部位器官，造成机体关节疼痛、畸变及功能障碍，严重影响患者日常生活[1-2]。免疫抑制剂及非甾体抗炎药为目前临床治疗RA的药物，二者在缓解RA患者临床症状及控制病情进展方面具有一定的作用，但总体治疗效果不佳[3-4]。研究显示，免疫抑制剂及非甾体抗炎药长期使用的毒副作用较大，且具有一定的依赖性，因此，其临床运用有限[5-6]。近年来，中医治疗RA以辨证论治和整体调节为特点，具有独特优势[7]。中医学认为，RA属“痹证”范畴，为风、寒、湿杂合侵袭机体，造成气血瘀滞、脉络痹阻所致[8]；祛风散寒、通络化湿为RA治疗的主要原则。《医学心悟》记载蠲痹汤具有除湿祛风、通络止痛、活血益气的功效。RA的病因病机复杂，是感染、炎症、环境及遗传等多因素作用的结果。研究显示，DNA甲基化异常是导致RA发生的主要表观遗传学机制；趋化因子主要对中性粒细胞起趋化作用，可在致炎细胞存在的情况下进行表达[9]。基于此，2020年8月—2021年2月，笔者采用蠲痹化湿汤联合西药治疗RA 45例，观察其临床疗效及对基质金属蛋白酶、DNA甲基转移酶和趋化因子的影响，以期为RA的防治提供参考，总结报道如下。

1 一般资料

选择新乡市中心医院新乡医学院第四临床学院收治的RA患者90例，按照1∶1的比例分为治疗组和对照组。治疗组45例，其中男14例，女31例；年龄36～74岁，平均(51.6±9.3)岁；病程1.5～8年，平均(3.3±1.3)年；关节功能分级为Ⅰ级14例，Ⅱ级24例，Ⅲ级7例。对照组45例，其中男16例，女29例；年龄35～72岁，平均(51.2±9.5)岁；病程1～8年，平均(3.2±1.5)年；关节功能分级为Ⅰ级13例，Ⅱ级23例，Ⅲ级9例。两组患者一般资料对比，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

2 病例选择标准

2.1 西医诊断标准

按照美国风湿病学会联合欧洲抗风湿病联盟制定的RA分类标准[10]。Ⅰ级：日常活动正常，不受限。Ⅱ级：关节活动中度受限，对日常生活不影响。Ⅲ级：关节活动受限明显，可影响患者正常的工作和生活等。Ⅳ级：丧失活动能力，卧床等。

2.2 中医辨证标准

按照《中医病证诊断疗效标准》[11]辨证为风寒湿阻证。主症：关节晨僵，屈伸不利，关节处伴有疼痛，关节肿胀，局部畏恶风寒。次症：腰膝酸软，肢冷不温，遇阴雨天症状加重。舌脉:舌苔薄白，脉沉弦。主症具备，次症符合2项，结合舌脉可确诊。

3 试验病例标准

3.1 纳入病例标准

①符合上述西医诊断标准，经影像学检查确诊者；②中医辨证为风寒湿阻证者；③身体质量指数(BMI)≤28 kg/m2者；④关节功能为Ⅰ～Ⅲ级，X线分期为Ⅰ～Ⅲ期的RA患者；⑤近1个月内未采用过抗风湿药、非甾体抗炎药治疗者；⑥可接受定期随访，且对本研究知情同意，并签署知情同意书者；⑦取得本院医学伦理委员会批准者。

3.2 排除病例标准

①严重肝肾功能障碍者；②骨关节炎、痛风性关节炎等疾病患者；③免疫性疾病患者；④恶性肿瘤患者；⑤哺乳及妊娠期妇女；⑥有严重内分泌、呼吸系统及感染性疾病者；⑦存在认知、精神障碍者。

4 治疗方法

对照组给予甲氨蝶呤片(由上海上药信谊药厂有限公司生产，产品批号070403A，2.5 mg/片)，7.5 mg/次，1次/周，口服；美洛昔康片(由江苏飞马药业有限公司生产，产品批号080803，7.5 mg/片)，7.5 mg/次，1次/d，口服。

治疗组在对照组治疗基础上加用蠲痹化湿汤，药物组成：独活15 g，羌活15 g，川芎15 g，乳香10 g，秦艽10 g，木香10 g，桑枝10 g，海风藤10 g，当归20 g，桂枝12 g，甘草6 g。加减：风气甚者，加防风10 g；寒气甚者，加附子10 g；湿气甚者，加薏苡仁15 g、防己10 g；痛在下肢者，加牛膝10 g；痛在上肢者，加荆芥6 g。1剂/d，水煎药汁至300 mL，2次/d，早晚温服。

两组均于连续治疗8周后判定疗效。

5 观测指标及方法

5.1 中医症状评分

按照《中药新药临床研究指导原则(试行)》[13]标准，对关节肿胀、疼痛、屈伸不利、晨僵、肢冷畏寒各项症状按无、轻、中、重、极重分别计0,1,2,3,4分，总分0～20分，评分越高表示症状越严重。

5.2 基质金属蛋白酶及趋化因子水平

抽取患者早晨空腹外周静脉血3 mL，高速离心分层(离心半径10 cm，转速3 000 r/min，离心10 min)，分离血清，采用ELISA法检测基质金属蛋白酶3(matrix metalloproteinase-3，MMP-3)、核转录因子-κB受体活化因子(receptor activator for nuclear factor-κB ligand,RANKL)、CC类趋化因子配体5(CC chemokine ligand-5，CCL5)、CXC趋化因子配体10(CXC chemokine ligand-10，CXCL10)及γ干扰素诱生蛋白10(interferonγ-inducible protein-10，IP-10)水平。

5.3 DNA甲基转移酶

采用RT-PCR法检测DNA甲基转移酶(DNMTs)，包括DNA甲基转移酶1(DNMT1)、DNA甲基转移酶3a(DNMT3a)、DNA甲基转移酶3b(DNMT3b)。采用Trizol法提取肿瘤组织总RNA，同时以1mL DEPC水进行溶解。使用反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA，反应条件：70 ℃，5 min，置于冰上；37 ℃，5 min，置于冰上；37 ℃，60 min，置于冰上；70 ℃，10 min，置于冰上。分析PCR结果，每例样品重复测量3次，取平均值，计算DNMTs表达量。上游引物：5′-CGCGGGCTCTCCAGAACATCATCC-3′。下游引物：5′-CTCCGACGCCTGCTTCACCACCTTCTT-3′。设置PCR反应条件。

5.4 不良反应

观察两组治疗期间有无发生肝肾损伤，以及胃肠道反应、头晕、皮疹、转氨酶升高等不良反应。

6 疗效判定标准

按照《类风湿关节炎病证结合诊疗指南》[12]，以疗效指数判定疗效。疗效指数=(治疗前积分-治疗后积分)/治疗前总分×100%。显效：临床症状消失，疗效指数≥70%。有效：临床症状改善，疗效指数为30%～<70%。无效：临床症状未改善，疗效指数<30%。

7 统计学方法

8 结 果

8.1 两组疗效对比

两组对比，经Ridit分析，u=2.15，P<0.05，差异有统计学意义。见表1。

表1 两组类风湿关节炎患者疗效对比 例

8.2 两组治疗前后中医症状评分对比

治疗后，两组关节肿胀、疼痛、屈伸不利、晨僵、肢冷畏寒评分和中医症状总评分均明显降低，且治疗组低于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表2 两组类风湿关节炎患者治疗前后中医症状评分对比 分，

8.3 两组治疗前后MMP-3水平对比

治疗后，两组MMP-3水平均明显下降，且治疗组低于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。见表3。

表3 两组类风湿关节炎患者治疗前后MMP-3水平对比

8.4 两组治疗前后DNMTs表达量对比

治疗后，两组DNMT1、DNMT3a、DNMT3b表达量均明显升高，且治疗组高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。见表4。

表4 两组类风湿关节炎患者治疗前后DNMTs表达量对比

8.5 两组治疗前后趋化因子水平对比

治疗后，两组RANKL、CXCL10、CCL5、IP-10水平均明显降低，且治疗组低于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。见表5。

表5 两组类风湿关节炎患者治疗前后趋化因子水平对比

8.6 两组不良反应对比

两组对比，经χ2检验，χ2=3.92，P<0.05，差异有统计学意义。见表6。

表6 两组类风湿关节炎患者不良反应对比 例

9 讨 论

RA的病因病机复杂，可能与遗传、感染、性激素等有关，可造成手、足小关节对称性、侵袭性关节炎症，导致关节畸形及功能丧失，严重影响患者的生活质量。甲氨蝶呤片为免疫抑制剂，为临床常用抗风湿药物，可对嘌呤核苷酸的合成产生抑制作用，减少细胞增殖，控制RA的发展，但抗炎、镇痛效果不明显[14]。美洛昔康片为非甾体抗炎药，可选择性抑制环氧化酶-2活性，减少机体局部炎症反应，改善毛细血管通透性，缓解RA患者的关节肿胀、疼痛、热、红等症状[15]。近几年的研究显示，西药治疗虽能在一定程度上缓解患者的临床症状，但普遍存在效果不佳、毒副作用大、依赖性较强等问题。

中医学认为，RA属“痹证”范畴。其病因主要涉及三个方面：其一，正气不足，导致风、寒、湿等邪气杂合并乘虚侵袭机体，侵入筋骨，造成筋脉痹阻，发为痹证；其二，风、寒、湿气入体充斥于经络，造成气血瘀滞，凝结为痰，阻于经络，引发肿胀和疼痛；其三，血脉亏虚，筋骨失养，阴阳失调，湿寒内生，阻滞关节，发为僵硬和屈伸不利[16-17]。因此，风、寒、湿痹为RA的主要病因机制。《医宗必读》曰：“治外者，散邪为急……治行痹者，散风为主……治风先治血，血行风自灭。”又曰：“治痛痹者，散寒为主，疏风燥湿，仍不可缺。”指出风寒痹证应以散风通络、化湿祛寒为主要治疗原则。

蠲痹化湿汤方中独活为君药，具有祛风散寒之效，善祛上部风湿，对于腰膝酸软、风寒湿痹者效果明显。独活有祛风散寒、止痛化湿之功效，善祛下部风湿；乳香活血止痛；秦艽具有祛风寒、清湿热、止痹痛的作用。三者配伍，祛风除湿，活血通络，共为臣药。川芎益气活血，祛风止痛；桂枝、当归具有活血补血之功效；木香活血益气，与桑枝、海风藤配伍使用可止痛化湿，有利于关节之活动。以上药物共为佐药。甘草为使药，调和诸药。诸药合用，共奏通络活血、祛风胜湿之效，与RA的病因机制切合[18-20]。本研究结果显示，治疗组治疗后关节肿胀、疼痛、屈伸不利、晨僵、肢冷畏寒评分及中医症状总评分均较对照组明显降低(P<0.01)，表明蠲痹化湿汤可改善RA患者的临床症状。

西医学认为，炎症反应在RA的发生及发展中起推动作用，可促进滑膜成纤维细胞、基质金属蛋白酶等大量释放，参与RA的发生及进展[21-22]。MMP-3为基质金属蛋白酶的一种，可作为早期RA的诊断标志因子，参与关节的损伤。本研究结果显示，治疗组治疗后MMP-3水平显著低于对照组(P<0.01)，其原因为蠲痹化湿汤方中独活、羌活、桂枝等药物均具有抗炎作用，可降低炎症，进一步对MMP-3诱导的骨质及软骨破坏进行调控[23]。此外，RA患者广泛存在基因组DNA低甲基化，而其甲基化形式的维持及形成主要依赖于DNMTs的表达。有研究指出，RA患者滑膜成纤维细胞内的DNA长散在核元件的启动子上GC的CpG岛序列丰富，其发生低甲基化后，可造成机体部分基因表达异常，进一步造成RA炎症发生[24]。本研究结果显示，治疗组治疗后DNMT1、DNMT3a、DNMT3b表达量均高于对照组(P<0.01)，提示蠲痹化湿汤可能通过上调RA患者低表达的DNMTs而恢复DNA甲基化水平，此结果可能与蠲痹化湿汤方中独活、羌活、川芎等药物的抗炎、改善肝脾失调等作用有关。趋化因子主要对中性粒细胞起趋化作用，可在致炎细胞存在的情况下进行表达。已有研究证实，趋化因子在RA关节病变中具有重要作用，可参与关节炎症反应，进一步破坏关节[25]。本研究结果显示，治疗组治疗后RANKL、CCL5、CXCL10、IP-10水平均明显低于对照组(P<0.01)，表明蠲痹化湿汤可抑制趋化因子表达，从而在RA的治疗中发挥作用。

综上所述，蠲痹化湿汤联合西药治疗RA有较好疗效，可有效改善临床症状，减轻机体炎症反应，降低趋化因子表达，上调DNA甲基转移酶表达。