烟草中拟除虫菊酯类农药残留分析技术研究进展

肖新生，张 慎，袁 芳，李佳颖

1.湖南科技学院化学与生物工程学院，湖南省永州市零陵区杨梓塘路130号 425199 2.湖南省烟草公司永州市公司，湖南省永州市冷水滩区珍珠北路69号 425100

1 烟草中拟除虫菊酯类农药应用与检测概述

拟除虫菊酯是文菊花中天然成分除虫菊酯的合成类似物。拟除虫菊酯类农药作为一类广谱的杀虫剂，1948年由美国农业部实验室人工合成。新开发的拟除虫菊酯类农药具有使用浓度低、触杀作用强、灭虫速度快、残效时间长及安全系数高等优点，是杀虫剂农药的一个新的突破。调查发现，我国烟草中害虫有200余种，病害有68种，严重影响了烟草生产安全［1］。为了保障烟草质量，使用化学农药防治是目前最有效的手段。拟除虫菊酯类农药对烟草多种害虫，如桃食心虫类、尺嫂类、扇舟蛾类、卷叶蛾类等，均有较好的防治效果。尽管过去一直认为拟除虫菊酯类农药在人体内易被氧化酶系统降解，无蓄积性，是低毒性的农药［2］。但后续研究资料表明，如果长期接触，即便是低浓度的接触，也会对人体免疫系统、神经系统以及血液循环系统等产生不利影响［3-4］。

为了保障烟草制品的质量安全，国际烟草科学研究合作中心（CORESTA）于2021年提出了包含10种拟除虫菊酯类在内的117种农药在烟草中的指导性残留限量（Guidance residue limits，GRLs）（表1）。欧美等国家和地区也制定了烟草中包含拟除虫菊酯类在内的农药最大残留限量（Maximum residue limits，MRLs）。由于氯氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、氟氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯等在烟草生产中的广泛使用，其残留也是每年烟草公司质量抽检的必检项目。因此，开展烟草中拟除虫菊酯类农药残留分析具有重要的意义。

表1 烟草中拟除虫菊酯类农药种类及指导性残留限量①Tab.1 Species and guidance residue levels of pyrethroid pesticides in tobacco

目前，关于食品或环境中拟除虫菊酯类农药残留量分析方法的报道较多，但由于烟草成分复杂，干扰成分多，这些方法并不能完全适用于烟草中拟除虫菊酯类杀虫剂残留的分析。尽管已经制定了烟草中有机氯和拟除虫菊酯类农药检测的行业标准，但是在实际使用过程中，还存在干扰因素多、定量不准、分析时间长、假阳性多等问题。因此，科研工作者对拟除虫菊酯类农药分析方法在烟草中的应用情况进行了持续深入的研究，为便于广大相关科研人员根据现有条件合理地选择烟草及其制品中拟除虫菊酯类农药残留量的分析方法，现将有关文献报道情况进行归纳总结。

2 烟草中拟除虫菊酯类农药分析方法研究现状

目前，拟除虫菊酯的分析方法主要有气相色谱-电子捕获检测器法（Gas chromatography-Electron capture detector，GC-ECD）、气相色谱-质谱联用法（Gas chromatography-Mass spectrometry，GC-MS）、气相色谱-串联质谱法（Gas chromatography-Tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）、液相色谱-串联质谱法（Liquid chromatography-Tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）、高效液相色谱法（High performance liquid chromatography，HPLC）等。有关拟除虫菊酯分析检测的综述已有较多报道［5-11］，而有关烟草中农药残留分析检测的综述也有少量报道［1，12］，但有关烟草中拟除虫菊酯检测方法的综述鲜见报道。以下对烟草中拟除虫菊酯残留几种主要的分析方法进行归纳，对比各分析方法的特点。

2.1 GC-ECD法

目前，分析烟草中拟除虫菊酯类农药残留量最主要的方法是GC法，并采用电子捕获检测器（ECD）。由于GC-ECD法对含电负性基团的分子具有较高的灵敏度，在有机氯、拟除虫菊酯和其他含电负性原子的农药残留分析中应用广泛。烟草中拟除虫菊酯类农药残留检测和农药降解规律研究的论文也大多选择该方法。烟草中拟除虫菊酯农药残留量测定的行业标准（YC/T 405.2—2011［13］）也采用GC-ECD方法。通过对相关文献的对比分析发现，研究对象既有鲜烟叶［14-19］，也有干烟叶和成品烟［13,20-29］；有多种农药的残留分析［13,15,21-24,27-31］，也有单种农药的残留分析［14,16-20,25,32］。不同文献中检测方法的差异主要表现在前处理方面；其次在色谱条件的优化方面也有所不同，特别是色谱柱的选择。

GC-ECD法检测烟草中拟除虫菊酯类农药的前处理对测定结果影响非常大，不恰当的前处理导致杂质干扰目标农药的定性定量分析。前处理一般均需经过提取和净化两个步骤。在提取步骤中，主要涉及的关键点为提取方法和提取溶剂的选择。目前，文献所涉及的主要提取方法及特点如表2所示。对于鲜烟叶中拟除虫菊酯的提取，大多文献中采用了组织捣碎匀浆法［15-16,18-19］。对于干烟叶中拟除虫菊酯的提取，早期文献中报道的是索氏提取法［18-19］，其后逐渐发展了机械搅拌提取［31,33］、涡旋振荡提取［21,34］、超声波辅助提取［13,20,23,25-27,29］和Quick-Easy-Cheap-Effective-Rugged-Safe（QuEChERS）提取［22］等方法。

表2 GC-ECD法检测烟草中拟除虫菊酯类农药残留提取方法比较Tab.2 Extraction methods of pyrethroid pesticide residues in tobacco by GC-ECD method

提取溶剂是另一个关注的热点问题，常采用的提取溶剂有丙酮［17-19,25,28-29,33-34］、丙酮-水［15,27,31］、乙腈-水［16,32］、石油醚［18-19,22］、环己烷［24,26］、石油醚-丙酮［14,20,25］、乙酸乙酯-正己烷［13,21,23］。早期的文献中也有用丙酮提取后，接着采用石油醚对烟叶再次进行提取的报道［17,28-29,33］；用乙腈提取后再用正己烷萃取乙腈提取液的方法也有报道［30］。喻学文［22］对QuEChERS方法中的提取溶剂乙腈和石油醚进行了比较，而石杰等［26］比较了环己烷、二氯甲烷、环己烷-乙酸乙酯等不同极性的有机溶剂或混合溶剂作为提取溶剂的提取效果，结果如表3所示。从表3的对比结果可以看出，采用非极性溶剂，提取效率较高。

表3 GC-ECD法检测烟草中拟除虫菊酯类农药残留提取溶剂比较Tab.3 Extraction solvents of pyrethroid pesticide residues in tobacco by GC-ECD method

GC-ECD法检测烟草中拟除虫菊酯类农药的前处理净化步骤中，主要采用的方法有填充玻璃净化柱分离、固相萃取小柱（Solid phase extraction，SPE）分离及凝胶色谱分离。采用填充玻璃净化柱净化时，一般在玻璃净化柱子两端各装2 g左右的无水硫酸钠，在中间装入15 g左右的弗罗里硅土或硅酸镁

吸附剂，洗脱剂可以采用不同比例的丙酮-正己烷或乙酸乙酯-石油醚混合溶剂。该方法操作相对繁琐，现逐渐被SPE技术所取代。目前，SPE有弗罗里硅土（Florisil）固相萃取小柱［13,22-23,26,31］、C18固相萃取小柱［14,25］、硅胶固相萃取小柱［20］、二元石墨化碳-氨基复合固相萃取小柱（PestiCarb-NH2，PC-NH2）和三元茶叶专用固相萃取小柱（Triple phase SPE for tea，TPT）［21］等。弗罗里硅土主要成分为硅酸镁，是具有弱碱性的硅酸盐吸附剂，主要吸附去除有机酸和强极性干扰物。氨基与弗罗里硅土类似，可以去除有机酸和部分色素等极性干扰物。C18可以去除脂类，而石墨化碳可以去除色素和部分芳香物质。Dattilo等［31］采用Florisil固相萃取小柱对烟草提取物进行净化，使用GC-ECD同时测定了烟草中8种拟除虫菊酯类农药。李樱等［30］对比了Florisil固相萃取小柱和大型Florisil硅土柱，石杰等［26］采用V环己烷∶V二氯甲烷=80∶20的混合溶剂为洗脱剂对比了硅胶柱和Florisil柱两种正相柱的净化效果，宋春满等［21］比较了Florisil单一填料、PC-NH2二元复合填料和TPT三元复合填料3种固相萃取小柱对烟草样品的净化效果，结果如表4所示。

表4 GC-ECD法检测烟草中拟除虫菊酯类农药残留的净化柱效果比较Tab.4 Purification column effects of GC-ECD method for determination of pyrethroid pesticide residues in tobacco

凝胶渗透色谱（Gel permeation chromatography，GPC）是利用不同体积的分子在多孔性凝胶中运动的路径长短不一，大分子（例如油脂、色素、生物碱、聚合物等）由于不能进入细微结构，先被淋洗出来，而农药等小分子的运动路径长，在凝胶柱中停留的时间长，后被淋洗出来。GPC在动物性食品复杂样品分析的前处理中应用广泛，因此也可应用于烟草等复杂基质中农药残留分析的净化。方敦煌等［15］采用GPC对烟草提取物进行净化，探讨了烟草中7种拟除虫菊酯农药在GPC柱上的流出规律。由于GPC价格比较昂贵，刘跃华等［27］采用普通的聚苯乙烯凝胶柱对其进行替代后，应用于烟草提取物中溴氰菊酯、高效氯氰菊酯、氟氯氰菊酯和S-氰戊菊酯的净化处理，在GC-ECD检测中取得了与GPC近似的净化效果。

凝结法通过将烟叶组织中提取出来的各种复杂干扰物转化为沉淀物，也应用在烟草拟除虫菊酯类农药GC-ECD检测前处理中。吕静等［33］、张雪燕等［34］分别将烟叶样品用丙酮提取后，再用石油醚萃取，然后用H3PO4-NH4Cl溶液凝结，最后分别采用填充弗罗里硅土和硅胶的玻璃柱进行层析净化，分别建立了烟草中6种拟除虫菊酯类农药残留量的检测技术。喻学文［22］研究发现，QuEChERS前处理步骤中，在加入硫酸镁和N-丙基乙二胺吸附剂（N-Propyl ethylenediamine adsorbent,PSA）净化之前，对溶解了农药的烟叶样品提取液进行15～20 min冷却处理，可使GC-ECD检测中拟除虫菊酯类农药色谱峰的分离度更高。

在GC-ECD分析检测步骤中，主要涉及色谱柱的选择和分析条件的优化等。色谱柱选择上，早期采用填充柱，如吕静等［33］采用填充3%（质量百分比，下同）的OV-101（3%聚二甲基硅氧烷-101）+3%APIEZON L（阿皮松L）+94%Gas chrom Q（硅藻土型色谱载体Q）固定相的玻璃柱，实现烟草中6种拟除虫菊酯类农药的分离。近年来，填充柱逐渐被毛细管柱所取代，毛细管柱内壁通过化学键键合的固定相主要有（5%苯基）甲基聚硅氧烷（对应色谱柱型号：DB-5［26］、HP-5［20］）、（14%氰丙基苯基）甲基聚硅氧烷（对应色谱柱型号：DB-1701［30］）等。ECD检测器对于载气的纯度要求较高，一般采用高纯氮气作为载气，要求纯度＞99.999%。也有文献报道采用高纯氢气［28］或高纯氦气［21,26］作为载气的。对于拟除虫菊酯类农药的分析，GC-ECD的检测限常可低至0.001～0.014 mg/kg［13］，灵敏度比GC-MS法高出10倍以上；而其不足之处为定性能力较差，导致假阳性比较严重，需要用另一根不同极性的色谱柱或者采用GC-MS进行验证。

2.2 GC-MS法

GC-MS法具有色谱的高效分离和质谱的准确定性定量能力，在拟除虫菊酯类农药检测中应用广泛［35-40］。同时，GC-MS法在烟草中农药残留检测、风味成分的检测、活性成分的检测等方面也有广泛应用［41-46］。而有关GC-MS法在烟草中拟除虫菊酯农药分析中的应用也有文献报道。

从现有文献看，既有单种农药残留的分析［47］，也有多种农药残留的分析［48-53］。在前处理过程中，陈雪等［47］采用填充了弗洛里硅土的玻璃柱进行净化，洪莲等［48］采用气流式微注射器萃取技术（Gas purge microsyringe extraction，GP-MSE）对烟草中6种拟除虫菊酯类农药进行萃取、浓缩和净化。Gao等［49］采用改进的QuEChERS方法，以乙腈-饱和盐水两相体系作为萃取剂，PSA作为净化剂，无需经过固相萃取柱，可以直接上机分析。牟定荣等［50］以超声波辅助乙腈萃取烟草中的拟除虫菊酯类农药，然后采用C18固相萃取小柱净化。曹建敏等［51］建立了包含6种常用拟除虫菊酯在内的烟草中40种农药的固相萃取GC-MS分析法。烟草样品用乙腈提取后，经TPT固相萃取小柱净化，然后采用GC-MS进行分析。Hou等［52］在前处理过程中采用搅拌棒吸附萃取技术（Stir bar sorptive extraction，SBSE）提取烟草中的5种拟除虫菊酯，然后采用热脱附系统将提取的物质热脱附后进行分析。Shen等［53］以水作为萃取剂，采用超声波辅助固相微萃取（Solid phase microextraction，SPME）进行前处理，以涂有聚二甲基硅氧烷的纤维膜作为固相萃取膜，整个前处理过程仅包含超声波辅助提取和固相微萃取步骤，所需总时间＜15 min。

GC-MS分析烟草中农药残留时，全扫描模式因灵敏度和选择性差没有被采用。选择离子扫描模式（Selective ion monitoring，SIM）在GC-MS检测烟草中拟除虫菊酯类农药残留的灵敏度和选择性可以满足要求，例如牟定荣等［50］、曹建敏等［51］、Hou等［52］和Shen等［53］均报道了相应方法。冯义志等［54］比较了GC-ECD、GC-EI-MS和GC-NCI-MS 3种不同检测方法测定烟草中氟氯氰菊酯的灵敏度，发现GC-ECD法的响应值高，选择性差，对净化要求高；GC-EI-MS法的响应值一般，但选择性强，基本无杂质干扰；GC-NCI-MS的响应值较高，选择性强，基本无杂质干扰。

采用GC-MS法分析烟草中农药残留时，方法的最低检测限、加标回收率和RSD数据如表5所示。可以看出，大部分文献报道的检测限、加标回收率和RSD均能够满足农药残留检测的要求。曹建敏等［51］采用GC-MS法对烟草中6种常用拟除虫菊酯农药进行分析时还发现，基质效应特别明显。

表5 GC-MS法检测烟草中拟除虫菊酯类农药残留的检测限、加标回收率及RSDTab.5 Limits of detection,spiked recoveries and RSDs of pyrethroid pesticide residues in tobacco by GC-MS method

2.3 GC-MS/MS法

因为GC-MS法单级质谱定量检测的灵敏度相对较低，同时在定性过程中容易出现假阳性，所以具有更高灵敏度和选择性的GC-MS/MS技术逐渐受到重视，成为农药残留分析的主流方法之一。GC-MS/MS法在拟除虫菊酯类农药残留分析方面的应用有不少文献报道［55-62］，我国也制定了GC-MS/MS测定拟除虫菊酯类农药残留的相关标准。近年来，将GC-MS/MS法应用到烟草中拟除虫菊酯类多种农药残留检测也有文献报道。Haib等［63］建立了一种以丙酮作萃取剂，利用加压溶液萃取技术提取农药，采用GC-MS/MS法分析烟草中拟除虫菊酯类农药残留的新方法；同时还对比了三重四极杆EI离子源GC-MS/MS、负化学电离源GC-MS与带荧光检测器的HPLC法检测农药的灵敏度和选择性。Lee等［64］也采用GC-MS/MS技术分析了包含氟氯氰菊酯、氯菊酯、氟氰戊菊酯、溴氰菊酯在内的烟草中49种农药残留，发现采用选择反应监控模式，气相色谱的分离效果对检测结果分析影响不大，农药残留的最低检测限在0.004～0.039μg/mL之间；该研究中还比较了前处理方法中所采用的PSA、C18柱、石墨化碳3种吸附材料，结果表明，采用QuEChERS法，以PSA为吸附剂，结合基质配标，测定结果的回收率和重复性最好。Cochran［65］将二维气相色谱-飞行时间质谱（GC×GC-TOF-MS）法用于烟草中有机氯、有机磷和拟除虫菊酯类农药的残留分析，效果也较好。陈晓水等［66］采用GC-MS/MS法测定烟草中包含拟除虫菊酯的132种农药残留，所测农药的定量限均低于0.02 mg/kg，平均回收率为68.10%～123.15%，RSD为1.79%～19.88%。陈黎等［67］采用GC-MS/MS测定高效氯氟氰菊酯和氰戊菊酯的方法，系统研究了烟草农药残留在大田生长期及加工过程中的变化规律。楼小华等［58］建立了烟草中包含拟除虫菊酯类在内的113种农药残留的GC-MS/MS分析方法，通过色谱柱的选择、分析参数的优化，实现了快速准确的分析。将与GC串联的ECD、MS、MS/MS 3种检测器在烟草中拟除虫菊酯残留测定的应用情况进行对比，结果如表6所示。

表6 GC-ECD、GC-MS、GC-MS/MS法测定烟草中拟除虫菊酯类农药残留的特点Tab.6 Characteristics of GC-ECD,GC-MSand GC-MS/MSmethods in determination of pyrethroid pesticide residues in tobacco

2.4 HPLC法

HPLC法具有高效的分离能力，广泛应用于检测分子量大、沸点高、受热不稳定的化合物。郭卫芸等［68］采用配备了二极管阵列检测器（Photo-diode array，PDA）的超高效液相色谱仪，实现了烟草中溴氰菊酯和气相色谱法不能检测的四溴菊酯的同时分析，结果表明，在6.5 min内可以完成对四溴菊酯和溴氰菊酯残留量的分析，定量限分别为0.33和0.23 mg/kg。虽然HPLC法已在烟草农药残留检测中有应用，但是常用检测器（如紫外分光光度计、折光仪、蒸发激光光散射仪等）对拟除虫菊酯类农药检测的灵敏度还有待进一步提高。灵敏度较高的荧光检测器要求样品必须带有荧光基团，而拟除虫菊酯等大多数农药分子中没有发光团，不能直接用HPLC法检测，因此，能采用HPLC检测的农药种类相对较少。

2.5 LC-MS/MS法

采用LC-MS/MS法进行样品分析时，样品混合物需先经高效液相色谱进行分离，然后进入质谱仪，在多反应监测（Multiple reaction monitoring，MRM）模式下进行定性定量分析。该方法具有较强的选择性和灵敏度，可对极性相对较大的农药分子进行有效分离和定性定量分析，且对柱分离效果要求不高，在农药残留分析中应用广泛。GB/T 20769—2008［69］中，采用LC-MS/MS法同时测定水果和蔬菜中450种农药及相关化学品，其中只包含胺菊酯、生物丙烯菊酯和生物苄呋菊酯3种极性相对较大的拟除虫菊酯类农药。YC/T 405.1—2011［70］中规定了73种农药的HPLC-MS/MS分析方法，但不包含拟除虫菊酯类农药。穆小丽等［71］探索了采用LC-MS/MS法测定烟草样品中拟除虫菊酯农药残留量的方法，通过对分析条件的优化，发现流动相体系对分析检测的灵敏度影响非常大；采用LC-MS/MS法最常用的乙腈-水流动相体系，氯菊酯和溴氰菊酯的灵敏度低，甲氰菊酯、氯氰菊酯和氟胺氰菊酯未检出；而采用V甲醇∶V水∶V乙酸铵=98∶2∶0.1混合液作流动相时，氯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯、氟胺氰菊酯和溴氰菊酯的检出限可低至0.000 5～0.005 0 mg/kg，色谱峰形好，平均加标回收率、RSD等符合大量样品快速检测的要求。廖雅桦等［72］采用凝胶渗透色谱-高效液相色谱-串联质谱法测定了烟草中包含氟胺氰菊酯、溴氰菊酯、氯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯5种拟除虫菊酯在内的50种农药残留量；HPLC分析的流动相为V甲醇∶V水∶V乙酸=98∶2∶0.002，拟除虫菊酯类农药的检测限为0.007～0.010 mg/kg，加标回收率为85%～108.5%，RSD为2.5%～10%。周晓峰［73］采用高效液相色谱-线性离子阱-静电场轨道阱组合式高分辨质谱测定了包含高效氯氟氰菊酯在内的6种农药在烟草中的残留量，高效氯氟氰菊酯的检测限为0.002 mg/kg，加标回收率为76.4%～95.1%，RSD为7.6%～9.0%。从现有文献报道看，LC-MS/MS法检测的烟草中拟除虫菊酯的种类不足以包含烟草中需要检测的种类，因此该方法的推广应用受到制约。

2.6 烟草中拟除虫菊酯的其他分析方法

除了上述分析检测方法外，对烟草中拟除虫菊酯农药残留的分析还有免疫分析法［74］、生物测定法［75］、电化学传感器法［76］、薄层色谱法［77］等。如刘媛等［74］研究了酶联免疫吸附分析法（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）在烟草中高效氯氟氰菊酯残留分析中的应用情况，建立了加标基质液的ELISA检测标准曲线，对50个施药后的烤烟烟草样品同时采用ELISA法和气相色谱法（具体为GC-ECD）进行对比分析，结果表明，ELISA法检测样本阳性检出率为34%，而GC-ECD法的检出率为22%。与GC法相比，尽管ELISA法的假阳性率为12%，但是其假阴性率为0，所以该方法常应用于进行大量烟草样本中氯氟氰菊酯残留量的快速筛查。Apostolou等［76］采用电化学生物传感器检测烟草样品中拟除虫菊酯，发现该生物传感器能够不受烟碱和烟叶其他生物碱的影响，烟草中低至1.5 mg/kg的氯氰菊酯均可检出。

3 展望

综上所述，对烟草中拟除虫菊酯类农药的检测已经发展了较多的方法和技术，其中以GC-ECD法应用最为广泛，GC-MS/MS和GC-MS法的应用也有一定量的文献报道，HPLC和LC-MS/MS法的文献报道较少。整体上，HPLC和LC-MS/MS法的检测灵敏度不高，影响了其应用范围。尽管GC-MS/MS法的灵敏度较好，但仪器价格相对较高，限制了其推广应用。免疫分析法、生物测定法、电化学传感器法、高效毛细管电泳法等一些新兴的检测方法，体现了较好的开发前景，但还需要进一步优化。

结合目前烟草中拟除虫菊酯类农药残留量检测的现状，提出今后研究的方向：一是开发新的拟除虫菊酯类农药的检测方法。为适应烟草病虫害防治情况的变化，一些新型的拟除虫菊酯类农药也不断开发出来，因此对于新型农药检测方法的研究仍需要持续进行；二是目前广泛采用的GC-ECD法中，仍然存在样品分析时间长、干扰因素多等问题，持续不断地对样品前处理技术进行优化，尚有很大的挖掘空间；三是针对LC-MS/MS法中拟除虫菊酯类农药灵敏度低的问题，进一步提高仪器性能并优化分析参数，从而实现包含拟除虫菊酯在内的烟草中多种农药的同时分析；四是加大对免疫分析、传感器技术、芯片技术以及分子印迹技术等一批新型技术的开发力度，实现烟草中痕量农药的高通量快速检测。