基于分子模拟技术的核因子κB蛋白解离阻滞化合物筛选

梁佳龙，刘飞远，孙智勇，刘建青

0 引 言

高原地区强紫外线辐射导致各类皮肤问题严重影响、困扰驻地群众、官兵的身心健康和工作、生活质量。有研究报道，喀喇昆仑高原进驻官兵皮肤患病率高于平原地区进驻者，达到54.29%[1]。诱发紫外线损伤的因素众多，其中核因子κB蛋白(NF-κB)是其中之一。NF-κB蛋白作为细胞中的核转录因子[2-3]，通常在细胞质中，以二聚体的形式存在[4]，处于非活化态。机体在受到细菌、病毒感染[5]，紫外线照射[6-7]，发生免疫、炎症和应激反应时[8]，抑制物I-κB可被激活并被泛素依赖性蛋白酶所降解[9-10]，从而释放出NF-κB，其进入细胞核内可以激活靶基因的转录[11]，影响细胞的分化和发育[12]，诱发细胞的无限增殖从而导致癌症。本研究旨在应用分子模拟技术寻找一种可以切断NF-κB解离功能的先导化合物，为研发抗紫外线损伤药物奠定基础。

1 材料与方法

1.1 数据来源Studer等[13]课题组的研究发现一种内源性化合物具有NF-κB解离阻滞功能，其在蛋白质晶体结构资料数据库(Research Collaboration for Structural Bioinformatics，Protein Data Bank，简称RCSB PDB)中编码是6SH6。

1.2 实验软件使用Discovery Studio 3.5(DS3.5)软件进行全部分子模拟计算。

1.3 药效团模型的构建为提高药效团模型对化合物数据库筛选的精度和成药性[14]，本研究药效团模型以基于配体-受体相互作用模式进行构建。在DS3.5软件中，π-π堆积的判断条件为两组结构几何中心相互之间的距离在5.5Å之内，且两组芳香环几何平面之间几何中垂线夹角在50°以内，氢键的判断条件为两组结构几何中心之间的距离在3.8Å之内。

1.4 虚拟筛选使用加州大学旧金山分校(UCSF)的ZINC15数据库进行数据库构建，依据成药五规则精简化合物，应用DS3.5软件中的build 3D 数据库工具构建化合物数据库，共得到10342180个符合成药5规则的化合物的数据库，从中再用药效团模型进行虚拟筛选。

1.5 分子对接为确定分子对接的算法优劣[15-16]，使用DS3.5软件中的Ligandfit、CDOCKER、Libdock三种对接方法分别将6SH6晶体复合物结构中内源性小分子与受体蛋白质进行对接，验证对接是否能重现6SH6中的结合作用模式，选用复现结合作用模式最佳的对接方法[17-18]，进行精密的分子对接实验，以便将对接结果最好的化合物筛选出来。

1.6 分子动力学模拟将分子动力学模拟的起始状态设定为1.5分子对接实验中获得的最优结构，使用DS3.5软件中的solvation算法模块，模拟细胞质溶液中的状态。使用标准动力学级联(standard dynamics cascade，SDC)算法进行分子动力学模拟，设定溶液基准温度为300K，动态过程选用升温-平衡-降温程序，平衡过程选用恒温恒压参数进行，采样间隔2fs，动态模拟500ns中结合作用模式的动态变化过程。计算受体蛋白的各氨基酸的均方根涨落(root mean square fluctuation，RMSF)值。RMSF值表示在分子动力学模拟的过程之中氨基酸运动的自由程度。在DS3.5软件之中，RMSF的计算原理是将氨基酸中的各原子作为一个整体，计算其在分子动力学模拟的整体时间之中偏移距离平方之和随时间平均的平方根。

2 结 果

2.1 内源性NF-κB解离阻滞化合物结合作用模式和药效团模型为寻找具有潜在阻断NF-κB解离过程的药物分子，本研究通过对6SH6晶体结构解析可知，其与受体蛋白之间可以形成多组相互之间作用，其三维结构见图1。其与I-κB蛋白之间相互作用，具体表现为：化合物的嘧啶并咪唑杂环于204Arg、401Phe共形成2组π-π堆积，距离分别为4.08 Å、4.48Å，呋喃环上的羟基与431Asp形成1组氢键，距离为2.31 Å，两个磷酸残基则分别于163Gly、164Ser、165Gly、166Lys、167Thr、168Thr形成氢键相互作用，距离分别是2.67 Å、3.10 Å、3.10 Å、2.67 Å、2.97 Å、2.93 Å。据此相互作用关系，课题组共构建了6个药效团的模型，分别包含了3组氢键受体、2组氢键供体和1组π-π堆积效应。

图1 内源性NF-κB解离阻滞化合物与受体蛋白结合三维结构图

2.2 粗筛结果使用ZINC15化合物数据库对上述构建的药效团模型进行筛选，共筛选出347个与药效团模型相符合的化合物。

2.3 对接方法选定与对接结果对Discovery Studio3.5软件中提供的3种不同分子对接方法(Ligandfit、CDOCKER、Libdock)进行预实验的结果显示，基于能量最低的CDOCKER方法在重复复合物晶体结构相互之间作用模式过程中表现最佳。因此上述通过药效团模型筛选得到的347个化合物与6SH6蛋白受体进行的分子对接，决定选用CDOCKER的算法进行。除去所有原本存在于6SH6复合物晶体结构中的配体分子，将蛋白质中的氨基酸残基全部补齐，并将其中的水分子去除，选用CHARMm力场作为分子对接的力场，对接区域范围设定为原化合物中心区域半径10Å范围，每个化合物对接结果均保留得分最高的10个构象。结果显示：276号化合物在前10个打分最高的构象中占了60%，其中排名第一的化合物结构见图2。

图2 276号化合物与与受体蛋白结合三维结构图

将内源性化合物与蛋白结合作用结构图与本研究筛选得到的276号化合物与蛋白结合作用结构图进行叠加，从中可见两者处于同一蛋白活性口袋中，具有高度相似的结合作用模式，证实筛选结果有效。见图3。

图3 276号化合物(灰红)、内源性化合物(绿色)与受体结合三维结构图

276号化合物结构中的8个磺酸基团分别于Lys133, Arg 134，Gly 165，Thr 167，Thr 168，Arg 204，Thr 426, Ser 427，Thr 429，Asp 431，Arg475，分别形成了11组氢键，距离分别为2.85Å、2.58Å、2.39Å、2.73Å、2.48Å、2.02Å、2.53Å、1.94Å、2.90Å、2.06Å、2.08Å。

2.4 分子动力学模拟结果276号化合物与6SH6的分子动力学模拟实验持续约16 h，体系温度维持在296.51～302.61 K之间。受体蛋白的各氨基酸的RMSF值见图4。 276号化合物与受体蛋白结合部位的氨基酸RMSF值较小，关键作用部位的结合作用稳定。

图4 受体蛋白各氨基酸均方根涨落(RMSF)图

3 讨 论

NF-κB可被细胞活素、氧自由基、吸入性颗粒、促有丝分裂剂、有毒金属、紫外线照射等激活，在皮肤癌的发生、发展和恶化之中起到了关键的作用。紫外线中的UVB照射皮肤后可促使皮肤内氧自由基形成，激活NF-κB，引起皮肤加速老化，皮肤肿瘤形成和免疫抑制反应导致急性皮肤晒伤。抑制NF-κB的活性，是化学药物预防皮肤癌和抗紫外线损伤发展的关键。目前一些NF-κB抑制剂已经被运用于皮肤癌治疗过程中，并取得了一定的效果。如何筛选出特异性强、不良反应小的NF-κB抑制剂是目前研究的关键。

尽管本研究得到的276号化合物在对接结果、动力学模拟等方面都展现出了其在抑制NF-κB解离方面可能具有一定的效果，但这种结果只是基于计算机模拟的结果，其真正是否具有药理活性，还需要动物实验来进行验证，但新药研发是一个长期且投入巨大的工作过程，而利用计算机的辅助筛选技术可以大大降低研究的时间和成本，提高新药发现的概率，而且随着学术界对NF-κB的蛋白质晶体结构的深入广泛研究，在一定程度上为我们发现NF-κB解离阻滞化合物方面，在筛选的准确性方面，提供了有力的保障。

与Studer等[13]课题组发现的内源性解离阻滞化合物相比，本研究中筛选得到的可能具有解离阻滞作用的276号化合物，两者与蛋白的相互作用都是静电相互作用，且都是电中性。虽然静电相互作用是这类分子与蛋白相互作用的关键，但从本研究筛选结果以及Studer等[13]课题组的研究结果看，化合物极性可能不是这类药物筛选的关键，但为了确保筛选结果的准确，后期本研究将对化合物不同极性的结合作用效果进行进一步验证，以期得到更好的先导化合物。

本研究得到的276号化合物是基于分子模拟技术的药物理性设计结果，其是否具有NF-κB解离阻滞效果还需要进一步的活性试验。后续可对6SH6蛋白进行定点突变，对Lys133, Arg 134，Gly 165，Thr 167，Thr 168，Arg 204，Thr 426, Ser 427，Thr 429，Asp 431，Arg475等氨基酸位点进行定点突变，观察其余受体蛋白结合的程度从而初步判断276号化合物的生物活性。

通常口服药物分子的相对分子质量不超过500，而276号化合物约为965.87，且其结构之中包含多个磺酸基的结构，在化合物成药性上存在一定的不足。之所以在打分系统中没有将相对分子质量低于500纳入打分系统，主要考虑在虚拟筛选过程中，化合物之间相互作用的稳定性更显得尤为重要。虽然化合物相互作用稳定性强且相对分子质量低于500的化合物是最理想的筛选结果，但从本研究中筛选得到的347个先导化合物中，相对分子质量低于500的先导化合物与受体蛋白之间的结合作用模式均弱于Studer MK课题组中的内源性化合物，因此本研究中保留了部分相对分子质量大于500的化合物结构。后期，在确保结合作用模式不减弱的情况下，课题组将重点考虑对276号化合物的结构进行改造，如考虑削减磺酸基基团，运用质量较轻且结构类似的基团进行替代，以改善其在体内的ADMET(Absorption吸收、Distribution分布、Metabolism代谢、Excretion排泄、Toxcity毒性)性质。

对于NF-κB解离阻滞化合物的研究，本课题组在现有研究基础上，下一步将对得到的276号化合物开展更为深入的理论研究，如：分子轨道能量、关键氨基酸残基的能量差异以及作用力特征等信息，从而对新药研发提供更多的理论支撑，此外建立紫外线损伤大鼠动物模型，尽早开展动物活性实验也是必不可少的工作。

本研究通过构建NF-κB的抑制蛋白I-κB与内源性配体之间的药效团模型，使用分子对接、动力学模拟技术，找到具有可能具有抑制NF-κB解离作用、可用于抗紫外线损伤的先导药物。通过对该先导化合物的结合作用模式进行分析、分子动力学模拟实验，显示276号化合物与I-κB蛋白可以形成稳定的作用模式，从而阻断NF-κB的解离。因此，276号化合物可能是潜在的NF-κB解离阻滞化合物，可能具有抑制外界刺激下细胞的无限增殖等癌变过程的效果。