一测多评法测定不同产地巴戟天中5种蒽醌类成分的含量

王丽丽，徐东亮，王诗涵

(1. 广州新华学院 药学院，广东 广州 510520；2. 吉林大学 药学院，吉林 长春 130021；3. 吉林农业大学 中药材学院，吉林 长春 130118)

0 引言

巴戟天(MorindaofficinalisHow.)为茜草科巴戟属植物[1]，来源于热带和亚热带地区,干燥根具有补肾阳、强筋骨、驱风湿、抗肿瘤、抗疲劳、抗衰老之功效，是我国著名的“四大南药”之一[2-3]。巴戟天可做药用，也是一种常见的保健食品原料。

研究表明，巴戟天含有蒽醌类、环烯醚萜类、糖类、氨基酸、有机酸类及微量元素等成分，其中蒽醌类成分具有抗骨质疏松、抗衰老的作用[4]。1-甲氧基-2-羟基蒽醌能够抑制肝癌细胞的增殖，且抑制率可达44.63%[5]，1,3-二羟基-2-甲氧基蒽醌对单纯疱疹病毒有一定的抑制作用[6]。

多指标定量测定已成为中药质量控制的发展趋势，传统的多指标定量测定存在着对照品消耗量大等缺陷。一测多评法(quantitative analysis of multi-components via single marker,QAMS)是通过一个指标性成分的测定来实现多个指标性成分的同时测定，该方法已被用于中药化学成分的含量测定[7-9]，但目前尚无采用一测多评法测定巴戟天蒽醌类成分的研究报道。本实验探索对巴戟天药材中1,3-二羟基-2-羟甲基蒽醌、1-甲氧基-2-羟基蒽醌、甲基异茜草素-1-甲醚、1,3,6-三羟基-2-甲氧基蒽醌、2-甲基蒽醌等5种蒽醌类成分的同步测定，为其质量评价提供参考。

1 仪器和试药

Agilent1260高效液相色谱仪；Waters Alliance E2695高效液相色谱仪；LC-10ATVP型岛津液相色谱仪；色谱柱：Venusil MP C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Agilent ZORBAX SB-Aq色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；Sartorious型十万分之一天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)；WP-UP-Ⅲ-10超纯水机(四川沃特尔水处理设备有限)。

对照品均采购于成都明睿科技有限公司，1,3-二羟基-2-羟甲基蒽醌(批号：478-08-0)；1-甲氧基-2-羟基蒽醌(批号：6170-06-5)；甲基异茜草素-1-甲醚(批号：7460-43-7)；1,3,6-三羟基-2-甲氧基蒽醌(批号：87686-86-0)；2-甲基蒽醌(批号：84-54-8)。11批巴戟天药材收集于广西、广东、福建、海南等地，经吉林大学王广树教授鉴定，为茜草科植物巴戟天( Morinda officinalis How.) 的干燥根，具体产地见表1。液相用甲醇、乙腈为色谱纯(美国Fisher公司)；定容甲醇为分析纯(北京化工厂)，水为超纯水(自制)。

2 方法

2.1 色谱条件

仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪；色谱柱：Venusil MP C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-0.3%磷酸溶液(B)，梯度洗脱(0～40 min，38%A；40～50 min，38%A→55%A；50～70 min，55%A→60%A)；流速：0.8 mL/min；柱温：30℃；进样量：10 μL；检测波长：266 nm。

表1 11批巴戟天药材来源Fig. 1 11 batches of M. officinalis How. source

2.2 对照品溶液的制备

精密称取1,3-二羟基-2-羟甲基蒽醌、1-甲氧基-2-羟基蒽醌、甲基异茜草素-1-甲醚、1,3,6-三羟基-2-甲氧基蒽醌和2-甲基蒽醌对照品适量，制成浓度分别为3.206 5、0.423 5、0.304 0、0.374 5、0.143 0 g/L的混合对照品储备液。精密量取混合对照品储备液0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.2、1.5 mL，置2.5 mL量瓶中制成一系列浓度的混合对照品溶液，避光低温保存。

2.3 供试品溶液的制备

称取巴戟天药材粉末约3 g，置圆底烧瓶中，加氯仿80 mL，回流提取两次，每次2 h，滤液蒸干，残渣用甲醇溶解并定容至2 mL，过滤，得到供试品溶液。

3 结果

3.1 系统适应性

混合对照品溶液与供试品溶液中各目标成分峰与峰的分离度均大于1.5；理论塔板数以所测目标成分计均大于8 000。详见图1、图2。

3.2 线性关系

定容、进样分析，以对照品浓度为横坐标(X，mg/L)，峰面积为纵坐标(Y)，进行回归计算，得到各对照品的标准曲线回归方程及线性范围，结果见表2。

注：1为1,3-二羟基-2-羟甲基蒽醌；2为1-甲氧基-2-羟基蒽醌；3为甲基异茜草素-1-甲醚；4为1,3,6-三羟基-2-甲氧基蒽醌；5为2-甲基蒽醌。

注：1为1,3-二羟基-2-羟甲基蒽醌；2为1-甲氧基-2-羟基蒽醌；3为甲基异茜草素-1-甲醚；4为1,3,6-三羟基-2-甲氧基蒽醌；5为2-甲基蒽醌。

表2 5种蒽醌类成分的线性关系考察Fig. 2 Investigation on the linear relationship of five anthraquinones

3.3 精密度

5种目标成分峰面积RSD值分别为0.27%、0.36%、0.37%、0.46%、0.60%。

3.4 稳定性

5种目标成分峰面积RSD值分别为0.22%、0.36%、0.71%、0.33%、0.35%。

3.5 重复性

5种目标成分峰面积RSD值分别为1.19%、1.61%、1.90%、1.37%、1.52%，平均含量分别为0.219 9、0.078 3、0.023 2、0.001 5、0.003 2 mg/g。

3.6 加样回收率

5种目标成分的平均回收率分别为100.33%、100.17%、99.04%、98.44%、102.22%，RSD值分别为0.37%、1.15%、0.84%、1.58%、1.88%。

3.7 相对校正因子

根据标准曲线y=ax+b，可以得出x=(y-b)/a=y/a-b/a，当a/b>100时，b/a值可忽略，此时x=y/a[10]。相对校正因子用二者斜率a之比计算，计算公式为：fk/s=ak/as。其中as为内参物斜率；ak为其他目标成分斜率。

本实验以1-甲氧-2-羟基蒽醌(Ⅱ)为内参物(1.000)，计算1,3-二羟基-2-羟甲基蒽醌(Ⅰ)、甲基异茜草素-1-甲醚(Ⅲ)、1,3,6三羟基-2-甲氧基蒽醌(Ⅳ)和2-甲基蒽醌(Ⅴ)的相对校正因子分别为0.0626、1.4614、1.2765、1.1582。

3.7.1 不同仪器及色谱柱对相对校正因子的影响

本实验考察了Agilent 1260、Waters E2695、LC-10ATVP色谱仪和两种不同色谱柱Agilent TC-C18和Venusil MP C18对相对校正因子的影响。结果显示目标成分相对校正因子RSD均小于2.00%，结果如表3所示。

表3 不同仪器和色谱柱对相对校正因子的影响Fig. 3 Effect of different instruments and columns on relative correction factors

3.7.2 不同技术人员对相对校正因子的影响

本实验考察了3名不同技术人员对目标成分相对校正因子的影响，结果显示，各目标成分相对校正因子的RSD值均小于2.00%。

3.7.3 待测成分色谱峰的定位

本实验考察了目标成分在3个不同色谱仪、2个不同色谱柱上的相对保留时间(t)，作为色谱峰定位参数。结果表明，各目标成分相对保留时间变化较小，RSD值均小于2.00%，结果如表4所示。

3.8 11批样品含量测定结果

每批药材制备2份平行供试品溶液，分别采用外标法(external standard method，ESM)和一测多评法计算各目标成分的含量，结果显示各目标成分含量相对标准偏差(RSD)均小于2.11%，结果如表5所示。

表4 不同仪器和色谱柱对相对保留时间的影响Fig. 4 Effects of different instruments and columns on relative retention time

表5 不同产地巴戟天5种蒽醌类成分测定结果Fig. 5 Determination of five anthraquinones in M. officinalis How. in different areas

4 结论

本实验建立的一测多评法，首次实现了巴戟天药材中5种蒽醌类成分的同步测定。此方法的建立，为巴戟天药材蒽醌类成分的含量测定节约了成本。不同产地的巴戟天中蒽醌类成分的含量差异较大，其原因可能与采摘时间及不同产地有关。

本研究为巴戟天的功效物质基础和开发利用提供了科学的理论依据。在此基础上，对其主要化合物的生物活性进行深入研究，可以为巴戟天作为药品或者保健品的开发提供必要的基础。