艾草和窃衣挥发物的提取鉴定及其对烟粉虱MED隐种成虫选择性的影响

徐会男, 穆 扬, 张战泓, 张 卓, 张德咏, 谭新球,史晓斌, *, 刘 勇, *

(1. 湖南大学研究生院隆平分院, 长沙 410125; 2. 湖南省农业科学院植物保护研究所, 长沙 410125;3. 湖南省农业科学院蔬菜研究所, 长沙 410125)

烟粉虱Bemisiatabaci属于半翅目(Hemiptera)粉虱科(Aleyrodidae)，危害多种作物，给农业生产造成严重的经济损失(Tayetal., 2017; Kanakala and Ghanim, 2019)。烟粉虱主要通过取食植物汁液、分泌蜜露造成煤污病、传播植物病毒等方式危害农作物(Oliveiraetal., 2001; 王雨蒙等, 2020)。烟粉虱体表有蜡粉，繁殖速率快，抗性发展迅速，目前已对一些杀虫剂产生了一定的抗药性，使得利用化学方法防治烟粉虱的效率大大降低；近年来，根据“推-拉”策略对烟粉虱进行绿色防治的方法引起了人们极大的关注(Cooketal., 2007; 朱铖培, 2008; Zhengetal., 2021)。

植物释放的挥发性化学物质在植食性昆虫和植物的通讯系统中发挥主要的作用，植食性昆虫往往被寄主植物挥发物吸引(Webster, 2012)，如：烟粉虱MED隐种雌、雄虫都能显著地被0.01和0.0001 μL/μL的芳樟醇、反-2-己烯醛和桉树脑吸引(李姝等, 2016)；柠檬烯是橄榄Canariumalbum的主要成分，其释放量越多，橄榄果蝇Bactroceraoleae对橄榄的危害程度就越大(Malheiroetal., 2016)。另外，植物挥发物也是植物防御昆虫的重要武器，非寄主植物往往能释放挥发性物质使昆虫躲避和远离，如：北艾Artemisiavulgaris和辽东蒿Artemisiaverbenacea释放的挥发性物质能够显著驱避和毒杀菊姬长管蚜Macrosiphoniellasanborni，使得蚜虫对北艾、辽东蒿的取食选择率均仅有16.7%(刘陈玮等, 2019)；从窃衣Torilisscabra中提取的植物精油能显著驱避赤拟谷盗Triboliumcastaneum，在含量为1.6 nL/cm2时，窃衣植物精油对赤拟谷盗的驱避率高达74%(赵娜娜等, 2019)。

利用挥发物的特性并根据“推-拉”策略对烟粉虱进行诱集或驱避已经成为防治烟粉虱的一项重要措施。例如，寄主植物反枝苋Amaranthusretroflexus对烟粉虱具有明显的诱集作用，在辣椒Capsicumannuum的主要生长期，采用集中式种植反枝苋后，对烟粉虱成虫和成虫产卵的诱集效果分别高达88.88%和94.2%(李秋荣等, 2019)。蓖麻Ricinuscommunis对烟粉虱具有明显的驱避作用，经蓖麻叶片粗提物处理的番茄Solanumlycopersicum上，烟粉虱的成虫迅速减少，处理1 d和2 d后虫口减退率分别达到45.61%和56.25%(赵斌等, 2010)。

田间作物收获后，杂草易助长虫害发生，并作为病毒传播的重要中间寄主(Kiletal., 2015; Orfanidouetal., 2016; Tangetal., 2017)。在前期研究中，我们发现艾草Artemisiaargyi和窃衣有较强吸引和驱避昆虫的作用。然而艾草和窃衣及其挥发物对烟粉虱MED隐种成虫的作用还未见有研究报道。为了更好地利用艾草和窃衣及其挥发物对烟粉虱MED隐种成虫实施绿色防控，本研究通过Y型嗅觉仪和四臂嗅觉仪分别测定了烟粉虱MED隐种成虫对艾草和窃衣的嗅觉反应和选择性，并利用气相色谱-质谱联用系统(GC-MS)对其挥发物成分进行鉴定分析,最后通过Y型嗅觉仪检测了艾草叶片中的主要挥发物α-可巴烯(α-copaene)和窃衣叶片中的主要挥发物环己烯(cyclohexene)对烟粉虱MED隐种成虫的作用，以期利用艾草和窃衣的挥发物开发食诱剂或驱避剂，为烟粉虱MED隐种成虫的防控提供新技术。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫与植物

实验用虫为烟粉虱MED隐种成虫，取自湖南省农业科学院植物保护研究所，饲养于研究所温室的棉花植株上。温室条件：平均温度为26℃±2℃，相对湿度为70%±5%，光周期为14L∶10D。

窃衣、艾草取自湖南省农业科学院草地上；气候条件：平均温度为27℃±2℃，相对湿度为85%±5%。番茄植株(钻红美娜)和黄瓜Cucumissativus植物(长春密刺)种植于湖南省农业科学院植物保护研究所；温室条件：平均温度为26℃±2℃，相对湿度为70%±5%，光周期为14L∶10D。

1.2 烟粉虱MED隐种成虫对4种植物的选择性测定

采用四臂嗅觉仪(上海贺帆仪器有限公司，上海)测定，其中Φ150 mm，深度30 mm，总厚度80 mm。四臂嗅觉仪置于暗室，室温为26℃±2℃，气流通过空气泵进入气口，经过洗气瓶去除杂质，并经过活性炭干燥，气流流速控制在300 mL/min。选取长势一致的番茄、黄瓜、艾草和窃衣幼苗，放入四臂嗅觉仪的4个味源瓶内，打开气阀通气4 h后，取饥饿处理2 h的烟粉虱MED隐种成虫约100头放入四臂嗅觉仪管口处，迅速关上管盖，待2/3烟粉虱选择完毕后，记录下嗅觉仪各诱集瓶内烟粉虱的数量，烟粉虱进入诱集瓶即做出选择，没有进入各诱集瓶即为未做出选择。每组试验重复4次。

1.3 烟粉虱MED隐种成虫对艾草和窃衣的嗅觉反应测定

用Y型嗅觉仪(上海贺帆仪器有限公司，上海)分别测定烟粉虱对艾草和窃衣的嗅觉反应，其中支臂长20 cm、主臂长8 cm、支臂夹角为60°、管内径2 cm。选取长势一致的艾草和窃衣幼苗，分别放入Y型嗅觉仪的味源瓶内，Y型嗅觉仪的另一端是空白对照，两臂的气流流速控制在300 mL/min。用锡箔纸将Y型管全部包住，防止光源不均匀影响烟粉虱的选择。通气4 h后，取饥饿处理2 h的烟粉虱MED隐种成虫约100头放入Y型管底部，迅速关上管盖，待2/3烟粉虱选择完毕后，观察并记录下烟粉虱选择数，烟粉虱进入到管2/3处即做出选择，没有进入各管即为未做出选择。每次试验后，用乙醇溶液和清水将Y型管清洗干净，烘箱烘干至无水滴状态。试验重复6次。

1.4 植物挥发物的提取及鉴定

艾草及窃衣叶片挥发物的提取：分别采集0.1 g艾草和窃衣的叶片，分别研磨后加入1.5 mL正己烷(色谱纯)。离心后取上清用于气相-质谱联用系统GC-MS鉴定。

GC条件：进样口温度240℃；程序升温：初始柱温50℃，保持1 min；然后以5℃/min升温至240℃，保持2 min；以30℃/min升温至300℃，保持5 min。

MS条件：EI离子源，电离能量70 eV，温度300℃；四级杆温度150℃；质量扫描范围：50～650m/z，扫描速度为0.5 scans/s。

整个实验重复9次，经GC-MS分析得到的所有化合物的质谱图均采用峰面积归一法处理及NIST数据库匹配分析。

1.5 烟粉虱MED隐种成虫对艾草、窃衣叶片主要挥发物的嗅觉反应测定

将α-可巴烯、环己烯、β-姜黄烯、6,6-二甲基-双环[3.1.1]庚烷-2-羧醛和茨醇标准品(购自坛墨质检有限公司，北京)用色谱纯正己烷作为溶剂，配制成浓度为100 μg/L的样品。取10 mL挥发物样品放入一个味源瓶内，另一个味源瓶以正己烷为对照，两臂的气流流速控制在300 mL/min。用锡箔纸将Y型管全部包住。通气2 h后，取饥饿2 h后的烟粉虱MED隐种成虫约100头从Y型管竖直管口放入，待2/3烟粉虱选择完毕后，观察Y型管两臂的烟粉虱数量并记录下数量。每次试验后，将Y型管用乙醇溶液和清水清洗干净，烘干至无水滴状态。试验重复6次。

1.6 数据分析

利用IBM SPSS Statistics 21进行数据分析。比较烟粉虱MED隐种成虫对4种不同植物选择性的数据采用one-way ANOVA方差分析，并用Duncan氏多重比较进行差异显著性分析，显著水平设为P<0.05；烟粉虱MED隐种成虫对艾草和窃衣及其挥发物α-可巴烯和环己烯的嗅觉反应数据采用t检验进行差异性分析，显著和极显著分别设为P<0.05和P<0.01。作图采用GraphPad Prism 7。

2 结果

2.1 烟粉虱MED隐种成虫对4种植物的选择性

烟粉虱MED隐种成虫对4种植物的选择性存在差异，其中对艾草和窃衣的选择数(分别为16头和9头)显著少于选择番茄和黄瓜的数量(分别为22头和21头)，对艾草的选择数显著多于对窃衣的选择数(F3, 15=3.906,P<0.05)(图1)。这些结果表明，烟粉虱MED隐种成虫对艾草的嗅觉反应显著小于对番茄和黄瓜的嗅觉反应，显著大于对窃衣的嗅觉反应。

图1 烟粉虱MED隐种成虫对4种植物的选择性

2.2 烟粉虱MED隐种成虫分别对艾草和窃衣的嗅觉反应

烟粉虱MED隐种成虫对艾草和窃衣的嗅觉反应结果显示，烟粉虱MED隐种成虫对艾草的选择数量(60头)极显著多于对空白对照的选择数量(22头)(F1, 11=292.703,P<0.01)；烟粉虱MED隐种成虫对窃衣的选择数量(22头)极显著少于对空白对照的选择数量(55头)(F1, 11=320.736,P<0.01)(图2)。这些结果表明,艾草对烟粉虱MED隐种成虫有较强的吸引作用，而窃衣对烟粉虱MED隐种成虫有较强的驱避作用。

图2 烟粉虱MED隐种成虫对艾草和窃衣的嗅觉反应

2.3 艾草和窃衣叶片挥发物成分含量

艾草和窃衣叶片中各组分挥发物成分见表1和表2。经GC-MS鉴定，艾草叶片中的挥发物有14种，窃衣叶片中的挥发物有16种。艾草叶片中挥发物主要为烯类物质，占总含量的74.2%。窃衣叶片中挥发物成分主要是烯类和醇类物质，烯类物质占总含量的40.9%，醇类物质占总含量的29.1%。本研究中含量大于10%的视为主要成分。艾草挥发物中的主要成分为α-可巴烯(12.0%)、(E)-β-金合欢烯(11.8%)、β-姜黄烯(11.8%)、2,6-二甲基-2,4,6-罗勒烯(11.7%)、叶绿醇(10.9%)、4-甲基-4-环己烯-1,2-二羧酸(11.4%)、β-依兰烯(10.0%)。 窃衣挥发物中的主要成分为环己烯(13.7%)、6,6-二甲基-双环[3.1.1]庚烷-2-羧醛(13.5%)、茨醇(13.3%)。

表1 艾草叶片挥发物成分和相对含量

表2 窃衣叶片挥发物成分和相对含量

2.4 烟粉虱MED隐种成虫对艾草和窃衣主要挥发物的嗅觉反应

烟粉虱MED隐种成虫对1 μg/L α-可巴烯的嗅觉反应实验结果显示，选择α-可巴烯的烟粉虱MED隐种成虫数量(60头)极显著多于选择对照的数量(24头)(F1, 11=64.614,P<0.01)(图3)。烟粉虱MED隐种成虫对 1 μg/L 环己烯的嗅觉反应实验结果显示，选择环己烯的头数(20头)极显著少于选择对照的头数(62头)(F1, 11=172.941,P<0.01)(图3)。

图3 烟粉虱MED隐种成虫对1 μg/L环己烯和α-可巴烯的嗅觉反应

3 结论与讨论

寄主植物释放的挥发性物质在昆虫识别和选择寄主中发挥着重要的作用(Fleischeretal., 2018; Scott, 2018)。由于不同寄主植物挥发性物质成分和含量的不同，同一种昆虫对不同植物的嗅觉反应也有所不同。例如，寄主植物洋桔梗Eustomagrandiflorum、杜鹃Rhododendronsimsii、百合Liliumbrowmii和菊花Dendranthemamorifolium的挥发物成分不同，黄胸蓟马Thripshawaiiensis对这4种植物的趋向性也有所不同，嗅觉反应依次为洋桔梗>杜鹃>百合>菊花(曹宇等, 2020)。本研究在测定烟粉虱MED隐种成虫对番茄、黄瓜、艾草、窃衣的行为趋向试验中发现，烟粉虱MED隐种成虫对艾草的趋向反应小于对番茄和黄瓜的，大于对窃衣的(图1)。已有多篇文献报道番茄和黄瓜是烟粉虱的嗜好寄主(Tianetal., 2020; Gorayebetal., 2021)，根据本研究结果可以推测，黄瓜和番茄中的吸引性挥发性物质多于艾草和窃衣中的吸引性挥发物质，艾草中的吸引性挥发物质多于窃衣中的吸引性挥发物质；也有可能是艾草和窃衣中的驱避性挥发物质多于黄瓜和番茄中的，窃衣中的驱避成分多于艾草中的。

本研究通过Y型嗅觉仪对烟粉虱MED隐种成虫进行行为趋向测试，结果显示烟粉虱MED隐种成虫对艾草的选择数极显著多于对对照组的选择数(图2)，说明艾草对烟粉虱MED隐种成虫有较强的吸引作用。该结果首次发现艾草对烟粉虱MED隐种成虫有吸引作用，这与文献发现艾草具有驱避昆虫的作用(Ahmedetal., 2020; 廖应江, 2020)不一致，有可能是由于季节和气候的不同导致艾草中的挥发物的不同(许再福, 2000; Lietal., 2020)。可能在一些特定的时期，艾草中释放的某些挥发性物质对烟粉虱MED隐种成虫有强烈的吸引作用，这时的吸引作用大于驱避作用；而在另外一些时期，艾草中释放的驱避性挥发物增多，导致艾草产生驱避作用。烟粉虱MED隐种成虫对窃衣的选择性试验结果显示，烟粉虱MED隐种成虫对窃衣的选择数极显著少于对对照组的选择数(图2)，说明窃衣对烟粉虱MED隐种成虫有较强的驱避作用。该试验结果与黄守敏和胡向奇(2020)发现小窃衣有驱避昆虫的作用一致，小窃衣提取物对玉米象24, 48和72 h都有较高的驱避效果，驱避率分别高达89.29%, 89.92%和78.95%。产生驱避的结果可能是窃衣释放的驱避性的挥发性物质较高，吸引性的物质较低。

艾草叶片中有14种挥发物。有研究发现，(E)-β-金合欢烯、叶绿醇、β-姜黄烯、萘都具有驱避昆虫的作用(Daisyetal., 2002; 范佳等, 2014; 王璐丰等, 2017; Antonious and Kochhar, 2020)，β-依兰烯和α-可巴烯具有吸引作用(Niogretetal., 2011)。烟粉虱MED隐种成虫对艾草的选择性试验表明艾草能够吸引烟粉虱MED隐种成虫(图1)，因此可以推测艾草叶片中的α-可巴烯和β-依兰烯是介导艾草吸引烟粉虱MED隐种成虫的重要物质。预试验中检测了烟粉虱MED隐种成虫对β-依兰烯的嗅觉反应，发现β-依兰烯对烟粉虱MED隐种成虫没有吸引作用。通过检测烟粉虱MED隐种成虫对α-可巴烯的嗅觉反应，发现α-可巴烯对烟粉虱MED隐种成虫有较强的吸引作用(图3)。该结果与我们的推测一致，证实了在特定阶段，α-可巴烯含量的增加导致了艾草对烟粉虱MED隐种成虫的吸引作用。窃衣叶片中有16种挥发物，其中茨醇、环己烯、6,6-二甲基-双环[3.1.1]庚烷-2-羧醛在窃衣叶片挥发物中总量中占有较大比例。目前还没有文献研究茨醇和6,6-二甲基-双环[3.1.1]庚烷-2-羧醛对昆虫的作用，本研究在预试验中检测了烟粉虱成虫对这2种物质的嗅觉反应，发现它们对烟粉虱MED隐种成虫没有驱避作用，并通过嗅觉反应试验验证了环己烯对烟粉虱MED隐种成虫具有驱避作用(图3)，可为后续研究提供参考。

本研究发现了α-可巴烯对烟粉虱MED隐种成虫表现出较强的吸引性，而环己烯对烟粉虱MED隐种成虫表现出较强的驱避性，在蔬菜种植地中可以利用α-可巴烯作为食诱剂来诱集烟粉虱MED隐种成虫，利用环己烯作为驱避剂对烟粉虱MED隐种成虫实施驱避，从而对烟粉虱MED隐种成虫进行绿色防控。本研究只选取了艾草和窃衣中的几种挥发物的一个浓度进行了验证，对于这几种挥发物的其他浓度是否具有吸引或驱避烟粉虱MED隐种成虫的作用，或者几种不同浓度的几种挥发物混合在一起是否能更好地吸引或驱避烟粉虱MED隐种成虫还未可知，有待进一步的检测鉴定。