高效液相色谱-串联质谱法测定葡萄酒中的柠檬酸

◎ 谭凯燕

（广西壮族自治区产品质量检验研究院，广西 南宁 530200）

葡萄酒中只有少量无机酸，大部分是有机酸。葡萄酒中的有机酸是决定葡萄酒风味的重要物质，也是决定葡萄酒酸度的主要因素，有机酸在葡萄酒酿造过程中及酿造后均占有重要地位。葡萄酒中的有机酸主要包括苹果酸、酒石酸、柠檬酸、乳酸和琥珀酸等，这些有机酸可调节葡萄酒的酸碱度，并直接影响葡萄酒的颜色、口感和生物稳定性。因此，葡萄酒中有机酸的定量测定对葡萄酒的品质鉴定具有重要意义[1]。

柠檬酸，又名枸橼酸，天然柠檬酸在自然界中分布很广，尤其是在果蔬中。在某些食品中加入柠檬酸后，可改善口感，促进食欲，还可促进身体的正常代谢，适当的剂量对人体无害，因此食品工业中其被广泛用作酸味剂、抗氧化剂和稳定剂。在葡萄酒的酿造过程中，适当添加柠檬酸可以维持和稳定葡萄酒的颜色，并调节葡萄酒的口感[2]。但其使用量在国家标准中有严格限制，《葡萄酒》（GB/T 15037—2006）中规定，干、半干和半甜葡萄酒中柠檬酸的含量≤1 g·L-1，甜葡萄酒中柠檬酸的含量≤2 g·L-1。《葡萄酒》（GB/T 15037—2006）中柠檬酸指定的分析方法为《葡萄酒、果酒通用分析方法》（GB/T 15038—2006）中的高效液相色谱法，按此方法测定葡萄酒中的柠檬酸时，由于葡萄酒中复杂基质的干扰，很难把柠檬酸完全分离出来，导致定性定量不准确[3-4]。目前，国内外报道中常见葡萄酒中柠檬酸的检测方法有高效液相色谱法和离子色谱法，未见有高效液相色谱-串联质谱法测定葡萄酒中柠檬酸的检测方法的报道。因此，有必要建立一种灵敏度高、定性定量准确、检出限低的检测方法，以改善上述方法的不足，研究建立高效液相色谱-串联质谱法测定葡萄酒中柠檬酸含量具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乙腈：色谱纯Fisher；饮用纯净水：娃哈哈饮料有限公司；甲酸：色谱纯，纯度98%；水相滤膜：0.22 µm，CNW；有机滤膜：0.22 µm，CNW；柠檬酸标准品，纯度为99.80%，Stanford Chemicals。

1.2 仪器与设备

超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪：美国 AB Sciex公 司；AcclaimTM RSLC 120 C182.2 µm 2.1 mm×100 mm色谱柱：美国Thermo公司；AG-285电子天平：瑞士AMTTLE。

1.3 方法原理

试样直接用蒸馏水稀释后，经高效液相色谱分离，选择质谱检测器进行定性、定量。采用外标法定量检测柠檬酸的含量。

1.4 试验方法

1.4.1 流动相的配制

流动相A（0.1%甲酸-水溶液）：取500 μL甲酸（色谱纯）加入500 mL饮用纯净水中，过0.22 μm水相滤膜，超声混匀去CO2即可。

流动相B（乙腈）：色谱纯，过0.22 μm有机滤膜，超声去CO2即可。

洗针液（10%甲醇溶液）：取20 mL甲醇（色谱纯）加入180 mL饮用纯净水中，过0.22 μm有机滤膜，超声混匀去CO2即可。

1.4.2 柠檬酸标准储备溶液

称取0.05 g柠檬酸于50 mL容量瓶中，用饮用纯净水溶解并定容到刻度，充分混匀。柠檬酸质量浓度为1.0 mg·mL-1，作为标准储备溶液，于2～4 ℃的冰箱冷藏储存。

1.4.3 标准曲线溶液配制

将柠檬酸储备溶液用饮用纯净水稀释成浓度分别为 0 μg·L-1、20 μg·L-1、50 μg·L-1、200 μg·L-1、400 μg·L-1和 1 000 μg·L-1的标准系列工作液。

1.4.4 仪器条件

（1）色谱条件。C18色谱柱，流动相为乙腈-0.1%甲酸/水（梯度洗脱，见表1），流速0.3 mL·min-1，柱温 45 ℃，进样量 5 μL[5]。

表1 梯度洗脱程序表

（2）质谱条件。电喷雾离子源，负离子模式（ESⅠ-）；多反应监测（MRM）模式，电喷雾电压为-4 500 V，离子源温度为550 ℃，雾化气、气帘气压力为55，按以上条件对柠檬酸的离子对进行摸索，最终确定目标化合物的离子对条件，见表2[5]。

表2 柠檬酸质谱监测参数条件表

1.4.5 样品的制备

移取1.0 mL葡萄酒样品放入100 mL容量瓶中，用蒸馏水稀释定容至刻度，混合均匀，过0.22 μm水相滤膜于进样瓶中，待测。

1.4.6 空白试验

不加样品，蒸馏水过0.22 μm水相滤膜于进样瓶中，待测。

1.5 结果计算

样品中柠檬酸的含量按式（1）计算。

式中：X为样品中柠檬酸的含量，g·L-1；c为测定溶液中柠檬酸的含量，μg·L-1；V为样液的最终定容体积，mL；m为取样量，mL；f为样品的稀释倍数；1000 000 为 μg·L-1转换为 g·L-1的换算因子。

2 结果与分析

2.1 标准曲线、线性范围和方法检出限

从图1可知，此高效液相色谱-串联质谱法测得柠檬酸在0～1 000 μg·L-1范围内标准曲线的相关系数为0.999 5。该方法的最低检出限为0.05 mg·L-1，最低定量限为0.15 mg·L-1（以葡萄酒样品稀释10倍时计算）。

2.2 回收率和精密度

向葡萄酒样品中分别加入柠檬酸标准品后，按照1.4.5步骤进行回收试验的验证，在不同浓度水平上（50 μg·L-1、200 μg·L-1、1 000 μg·L-1）加标，每个加标浓度均进行6次平行试验。回收率最低为90.1%，最高为107.0%，平均回收率为96.0%，相应的变异系数（RSD）为2.1%～7.6%，说明该试验的回收率和精密度较好。

2.3 样品的测定

10个不同厂家的葡萄酒样品按1.4.5方法进行处理后，按照1.4.4仪器条件进行测定，根据峰面积采用外标法计算柠檬酸含量，结果满意。

3 讨论

3.1 液相色谱法试验情况

取不同厂家的10个葡萄酒样品，采用国家标准GB/T 15038—2006中液相色谱法测定葡萄酒中的柠檬酸，样品经稀释后直接用液相色谱仪分析，其中7个葡萄酒样品的液相色谱无法将样品中其他组分与柠檬酸完全分离（如图2所示），这样极易造成定性判定错误，并造成检测结果定量不准确[2]。另外3个葡萄酒样品的液相色谱基本能将样品中其他组分与柠檬酸分离（如图3所示），但色谱基线波动大，仅靠保留时间定性定量，也很难保证检测结果的准确性。

3.2 高效液相色谱-串联质谱法试验情况

取上述不同厂家的10个葡萄酒样品，经稀释后采用此液相色谱-串联质谱法检测，10个葡萄酒样品的MRM色谱图与柠檬酸不同浓度标准溶液及葡萄酒样品1、样品2的MRM图基本一致（见图4），葡萄酒样品溶液中的柠檬酸峰型极好，周围无杂峰干扰，基线平稳，不受样品中复杂基质的影响，能准确完成葡萄酒样品中柠檬酸的定性定量分析。

4 结论

经过试验比较验证，葡萄酒样品经简单稀释处理，选择高效液相色谱-串联质谱法仪检测，可以得到准确的柠檬酸的定性定量结果。说明高效液相色谱-串联质谱法准确、高效、重现性好，并能有效消除样品中其他组分对目标峰的干扰，灵敏度高、定性定量准确、检出限低，可用来准确分析葡萄酒中柠檬酸含量。