活性小分子提高Par-4水平的研究进展

莫安娜，谢旭，廖海缘，唐美丽，刘冬成

(1.广西师范大学医院药剂科，广西 桂林 541004； 2.广西国际壮医医院健康管理中心，南宁 530201；3.广西师范大学化学与药学学院，广西 桂林 541004)

癌症由组织细胞恶性增生导致，其发病人数多，分布年龄广泛，致死率高。据报告显示，全球癌症患者和死亡病例呈逐年增长趋势，全球癌症病例2012年为1 400万，预计2025年递增至1 900万，2035年将达到2 400万[1]。手术、放疗、化疗、免疫治疗虽是现代癌症治疗的四大主要方案，但由于手术切除范围的限制以及放疗、化疗的个体化敏感差异和严重的不良反应，肿瘤治愈率低、复发率高。因此，发现更多的药物靶点，设计出能同时作用于多个靶点或通过联合用药进而提高肿瘤细胞敏感性的药物，是提高肿瘤患者的响应率和实现肿瘤治疗向慢性病治疗转变的难点。而肿瘤靶向治疗和免疫治疗因其高效、低毒、专一靶向性等特点，逐渐成为当今新型抗肿瘤药物研究的热点。

前列腺凋亡反应基因-4编码的产物前列腺凋亡反应蛋白(prostate apoptosis response protein-4，Par-4)，首先在前列腺癌细胞中被发现，Par-4能够选择性地诱导肿瘤细胞发生凋亡而不影响正常细胞的生存和生长，因此成为近年肿瘤治疗的新靶点。目前普遍认为，Par-4主要通过活化胱天蛋白酶(caspase)-3/9参与线粒体凋亡途径[2-3]，并通过活化caspase-3/8参与经典的Fas相关死亡结构域蛋白(Fas-associated death domain protein，FADD)/caspase-3/8死亡受体凋亡途径[4-5]共同诱导肿瘤细胞凋亡。Par-4具有优良的抗肿瘤特性，所以研发机体内提高Par-4水平的小分子促泌剂药物成为新型抗肿瘤药物研究的热点。铂类药物的成功应用体现了金属配合物药物的巨大潜力。铂类药物虽然广泛用于多种癌症的化疗，但仍受到不良反应严重、缺乏选择性和耐药性的限制[6]。因此，研究具有低毒性和高选择性[7-8]的新型金属化疗剂成为抗肿瘤治疗的新策略。现就近年有关提高Par-4水平的活性小分子的研究进展予以综述。

1 Par-4概述

前列腺凋亡反应基因-4属于前列腺雄激素调节基因家族成员，位于人第12号染色体长臂上，其编码产物为Par-4。Par-4包含343个氨基酸，是一种亮氨酸拉链结构域蛋白，分子量约为40 000，广泛存在于不同类型的正常组织和癌细胞中[9]。内源性Par-4本身不会引起细胞凋亡，但旁分泌过表达的外源性Par-4对诱导肿瘤细胞凋亡至关重要。

Par-4有一个对肿瘤细胞凋亡具有选择性的结构域，即选择性肿瘤细胞凋亡诱导域(selective for apoptosis induction cancer cells domain，SAC)，由59个氨基酸组成，是Par-4发挥促凋亡作用不可或缺的功能性结构域[10]。研究表明，只有SAC上的关键位点T163被蛋白激酶A磷酸化后才能诱导细胞凋亡[11]。虽然正常细胞中的SAC过表达[10]，但正常细胞内的高内源性蛋白激酶A水平显著低于肿瘤细胞中蛋白激酶A水平，不能将T163磷酸化，所以灭活的SAC失去诱导健康正常细胞发生凋亡的能力[12]。

Par-4同时存在于细胞质和细胞核中，但肿瘤细胞对Par-4的促凋亡具有抗性。研究发现，在胰腺癌、子宫内膜癌、神经母细胞瘤、乳腺癌和白血病等肿瘤细胞中，Par-4水平被下调超过70%，说明肿瘤对Par-4有抑制作用[9-10,13-14]。

2 Par-4促进肿瘤细胞凋亡的作用机制

目前普遍认为，Par-4主要通过胞内凋亡通路和胞外旁分泌通路共同诱导肿瘤细胞发生凋亡。同时，Par-4还可与许多细胞内的凋亡相关蛋白作用，促进肿瘤细胞凋亡，包括非典型蛋白激酶C、Wilm′s肿瘤基因1、死亡相关蛋白样激酶/Zipper相互作用蛋白激酶，以及含有死亡相关蛋白结构域的蛋白1、多巴胺D2受体和蛋白激酶B等[9,14-15]。

其中，内源性Par-4通过激活胞内凋亡通路及抑制胞内存活路径诱导肿瘤细胞凋亡。一方面，Par-4促进Fas/Fas配体转移至细胞膜上，并进一步募集FADD[14,16]，吸引caspase-8酶原形成死亡诱导信号复合体，并特异切割caspase-8酶原成活性caspase-8，促使caspase大量活化诱发caspase级联反应，进而引起细胞凋亡[17]。目前认为，这是Par-4最主要的诱导细胞凋亡途径。过表达的Par-4不仅下调Bcl-2蛋白家族中抗凋亡蛋白的表达，还显著增加了抑癌基因p53及其下游靶标p21的表达[18]。Par-4通过与Bcl-2启动子上的WT1位点结合并下调Bcl-2翻译，改变线粒体的膜电位，进而改变其通透性，引起钙离子内流，胞内活性氧增加和活化caspase-3/9等，最终促进肿瘤细胞凋亡[2,19-20]。另一方面，Par-4在Asp-131处被caspase-3裂解，生成功能活性cl-Par-4，通过抑制蛋白激酶C活性和核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)抑制蛋白激酶磷酸化，抑制NF-κB介导的细胞生存途径，引起肿瘤细胞选择性凋亡[21-22]；同时，Par-4的亮氨酸拉链通过抑制拓扑异构酶Ⅰ的活性使得DNA不能解旋，从而影响基因复制和转录，最终诱导肿瘤细胞生存和发展[23]。

与内源性Par-4诱导肿瘤细胞凋亡通路不同，当细胞外界条件发生改变(如缺氧、营养不足)时，内质网的正常功能受到影响，大量未成熟的蛋白在其内聚集，引起内质网应激，Par-4通过经典途径被分泌到胞外。外源性Par-4的SAC与肿瘤细胞表面过表达的葡萄糖调节蛋白78 的N端特异性结合，引发FADD/caspase-8/caspase-3细胞凋亡通路，导致肿瘤细胞凋亡。而正常细胞表面的葡萄糖调节蛋白78水平较低，不能被细胞外的Par-4识别，所以正常细胞能够逃避旁分泌Par-4诱导的凋亡[9,14-15]。有研究发现，Par-4不仅在预防癌症发展和复发方面发挥重要作用，还可以作为一种有前景的抗肿瘤治疗剂[24]。

3 提高Par-4水平的活性小分子

研究表明，不同的药物和蛋白质、酶等小分子可调节Par-4水平，包括植物和微生物衍生物活性小分子以及人工合成的化合物分子等[9]。这些活性小分子通过结合细胞内的波形蛋白，将Par-4从波形蛋白中置换出来，游离的Par-4能够自发分泌至胞外，通过旁分泌通路引起肿瘤细胞凋亡，见图1。

注：Par-4为前列腺凋亡反应蛋白-4

3.1来自植物或微生物的活性小分子 近年来，研究者相继从植物中发现具有调节Par-4表达能力的天然化合物。毒毛花苷是一种源自毒毛旋花的糖苷，最初作为心脏渗透剂使用。Huang等[25]将毒毛花苷用于前列腺癌细胞(PC-3细胞)，当Par-4的表达受到抑制或Par-4被敲除时，低剂量毒毛花苷的抗肿瘤细胞增殖作用降低，表明毒毛花苷治疗前列腺癌是通过剂量依赖性方式增加Par-4的表达。

醉茄素A是天然植物睡茄的主要提取物之一，具有抑制多种肿瘤细胞生长的作用。2007年，Srinivasan等[26]首先描述了醉茄素A在PC-3细胞中的抗肿瘤活性及其作用机制。醉茄素A的促肿瘤细胞凋亡作用是通过诱导Par-4的分泌来抑制NF-κB和Bcl-2的表达，并激活caspase级联反应。在醉茄素A对PC-3裸鼠移植瘤的抑瘤实验中，与对照组相比，醉茄素A治疗组显示出显著的肿瘤生长抑制和Par-4上调功能，其Par-4上调功能与叉头框转录因子(forkhead box，FOX)O3a活性相关[9]。FOXO3a是由FOXO3基因编码的人类蛋白质，与肿瘤的发生密切相关，又称为肿瘤抑制器[27-28]。

MacLean等[29]发现了北美的蔓越莓提取物对几种肿瘤细胞株的细胞周期和凋亡的影响。北美的蔓越莓提取物能促进Par-4上调，激活caspase-8和caspase-9，并促进肿瘤细胞凋亡。另一种从希腊中部和南部特有植物Onobrychis ebenoides中分离出的对人类癌细胞具有细胞毒作用的化合物Eb Ⅲ(Ebenfuran Ⅲ)也能影响Par-4的表达。Roumeliotis等[30]研究了Eb Ⅲ的细胞毒性作用及其在前列腺癌细胞(DU-145细胞)中的促肿瘤细胞凋亡作用机制。结果表明，药物作用后体外细胞中的Par-4水平明显升高，提示Par-4可能在Eb Ⅲ诱导DU-145细胞凋亡中起关键作用。

姜黄素是从姜黄根茎中提取的植物多酚，是一类具有迈克尔受体结构单元的重要天然产物，具有抗炎、抗氧化、抗感染和抗肿瘤等药理活性[31-33]。Thayyullathil等[34]研究证实，姜黄素可上调细胞内Par-4水平，通过活性氧依赖的Par-4诱导触发人类恶性神经胶质瘤细胞的自噬。同时姜黄素还是一种天然的β-二酮类配体，可与多种金属螯合形成配合物。以姜黄素为配体合成的金属钯(Ⅱ)、铂(Ⅱ)、钒(Ⅳ)和钴(Ⅲ)等配合物具有较姜黄素更好的抗肿瘤活性[35-38]。但目前有关姜黄素类金属配合物提高机体Par-4水平的报道较少。

另一些研究是通过转基因植物来诱导必需治疗分子的大规模生产。Sarkar等[39]于2015首先报道了转基因烟草中Par-4的SAC-Par-4-绿色荧光蛋白在PC-3和MAT-LyLu前列腺癌细胞系中表现出细胞毒作用并能抑制NF-κB活性[40]。为延长Par-4寿命，进而提高Par-4的体内性能，Kim等[41]使用适合大规模生产的大肠埃希菌表达系统开发出一种新型、持久的Par-4扩展序列Par-4Ex，并证明Par-4Ex完全保留了Par-4的促凋亡活性，但生物半衰期延长了约7倍；体内实验证实，由于生物半衰期延长，Par-4Ex蛋白在抑制小鼠转移性肿瘤生长方面更有效。

3.2人工合成和半合成的活性小分子 在天然活性小分子的基础上，研究者们合成和半合成了许多激活Par-4的化学小分子，它们具有较天然活性分子易获取、产量高或稳定性高等特点，也是潜在的抗肿瘤药物。如Rossi等[42]评估了雷洛昔芬激活相关促肿瘤凋亡信号通路及体外肿瘤细胞中的Par-4水平发现，经雷洛昔芬治疗后，从前列腺癌细胞中提取的Par-4信使RNA和Par-4表达均明显增加，且肿瘤细胞内的caspase-3被显著活化。

3-叠氮基醉茄素A是一种稳定的半合成药物，表现出有效的抗肿瘤活性。Rah等[43]发现经3-叠氮基醉茄素A可诱导正常细胞通过经典的旁分泌通路发生剂量依赖性的细胞外Par-4分泌。Rah等[44]发现，较低浓度的3-叠氮基醉茄素A能使PC-3和DU-145细胞自噬扩增，而在较高浓度的3-叠氮基醉茄素A中细胞自噬消失同时Par-4表达上调，肿瘤细胞凋亡增加，表明肿瘤细胞自噬向凋亡的转换通过Par-4介导抑制抗凋亡蛋白Bcl-2和Beclin-1的活性实现。

哒嗪环稠合香豆素具有促进Par-4分泌的功能。Frasinyuka等[45]合成并研究了香豆素的衍生物6H-苯并吡喃[3,4-c]吡啶并[3′,2′:4,5]噻吩并[2,3-e]哒嗪-6-酮的抗肿瘤活性，结果发现，该衍生物可上调小鼠胚胎成纤维细胞中Par-4的水平，并降低PC-3和DU-145细胞的活力，从而诱导肿瘤细胞凋亡。

喹啉类化合物广泛存在于各种天然和合成的产品中，包括一些重要的临床使用的药物和常见候选药物[46-48]。喹啉衍生物具有多种生物活性，包括抗疟疾、抗菌、抗病毒和抗肿瘤等[49-50]。Sviripa等[51]通过荧光抗体标记Par-4，共聚焦显微镜跟踪显示，在正常细胞内Par-4与波形蛋白结合，而3-芳基喹啉或芳基喹啉类药物能取代Par-4与波形蛋白结合，刺激正常细胞大量分泌Par-4，这些外源性Par-4进入体循环，与肿瘤细胞表面过表达葡萄糖调节蛋白78受体结合，激活细胞凋亡通路，并通过抑制核内NF-κB细胞存活通路和拓扑异构酶I活性共同作用导致肿瘤细胞凋亡。

Burikhanov等[52]研究发现，抗疟药氯喹及其羟基酰化类似物可作为强效Par-4分泌诱导剂。氯喹刺激机体正常细胞大量分泌Par-4与抑癌基因p53及其转录靶点Rab8b有关，氯喹通过激活Par-4旁分泌促凋亡通路，有效地促进荷瘤小鼠和临床癌症患者的肿瘤细胞凋亡及抑制肿瘤细胞中上皮向间充质的转变和侵袭。在一项关于肾细胞癌患者的临床试验中，氯喹还引起了Par-4的全身分泌[53]，故其有望作为抗肿瘤药物进行进一步的研究和临床试验。

具有N杂环相邻的甲酰基/乙酰基的喹啉骨架可以很容易地与带有氨基的药效团连接，得到席夫碱金属配合物。通过以喹啉类化合物作为优良配体，已经报道合成了一系列具有抗肿瘤活性的喹啉类席夫碱铜(Ⅱ)配合物[54-57]。然而，作为潜在Par-4促泌剂的3-芳基喹啉及异喹啉类衍生物的金属配合物研究较少。故通过对喹啉类金属配合物结构进行修饰与合成，有望获得一系列新型Par-4促泌剂。

4 Par-4的联合抗肿瘤治疗

Par-4靶点的研究展现了它在抑制和治疗结肠癌、前列腺癌、白血病、淋巴瘤、胰腺癌、乳腺癌、神经胶质瘤和肾癌等肿瘤方面的巨大潜力[9]。Kline等[58]通过纳米脂质体传递Par-4质粒，产生过表达的Par-4，实验证明Par-4在体外和体内均不同程度增加结肠癌细胞对5-氟尿嘧啶的反应，继而降低肿瘤的生存力。在白血病细胞中，Par-4的激活不足以诱导细胞凋亡，但过表达的Par-4可增加细胞对诱导细胞凋亡药物的敏感性[9]。因此推测，提高细胞内Par-4水平可作为治疗肿瘤的新策略。

Brasseur等[59]研究发现，雌激素通过调控Par-4的活力及其定位，进而影响Par-4的表达。这种雌激素依赖性调节的发生，通过与DNA调控元件的直接结合和激素的抑制恢复Par-4的凋亡能力[60]。雌激素与Par-4呈负相关，且Par-4对激素非依赖性肿瘤细胞(如乳腺癌细胞MDA-MB-468)具有良好的杀伤力，故Par-4可作为妇科肿瘤治疗的另一个靶点[14,61]。顺铂是常用的广谱抗肿瘤药物，但其易产生耐药性。实验证明，增加Par-4水平可以提高肿瘤对顺铂的敏感性和临床疗效[46]。Wang等[62]将Par-4与顺铂共同作用于肾母细胞瘤细胞SK-NEP-1发现，与单独使用顺铂对比，顺铂联合Par-4治疗荷瘤小鼠体内的肾母瘤细胞被大量诱导凋亡。因此，Par-4联合顺铂治疗方案可为未来肾母细胞瘤治疗提供新思路。

5 小 结

Par-4是一种选择性的肿瘤抑制蛋白，对正常细胞影响较小，其不仅具有选择性诱导肿瘤细胞发生凋亡的特性，还具有与其他抑癌因子相互协调的作用，具有巨大的肿瘤治疗潜力。但目前关于Par-4促泌剂的研究较少，其中3-叠氮基醉茄素A、香豆素衍生物、喹啉和异喹啉类衍生物以及姜黄素衍生物等新型化合物均具有良好的抗肿瘤活性，同时能够显著上调Par-4水平。而通过过渡金属与生物活性配体合成金属配合物是开发抗肿瘤药物的有效途径之一，因此推测，将已知具有抗肿瘤活性、能提高Par-4水平的化合物作为母体进行结构修饰和改造，或将这些化合物作为优良配体与具有潜在抗肿瘤活性的金属离子(铂、铜、金、钌等)配位合成新型金属配合物，有助于筛选出更多具有显著提高Par-4水平的抗肿瘤药物。