依巴斯汀对Balb/c小鼠特应性皮炎模型的作用研究

华思瑞 徐可佳 王 琳

四川大学华西医院皮肤科，四川成都，610041

特应性皮炎(atopic dermatitis, AD)是与遗传、环境、皮肤屏障功能障碍及免疫功能失调等多因素有关的慢性复发性炎症性皮肤病。半抗原2，4-二硝基氟苯(2,4-dinitrofluorobenzen，DNFB)是一种接触致敏抗原，体积小，易穿透表皮与组织蛋白结合引发免疫反应，通过反复外用小鼠可产生AD样病变[1]。依巴斯汀是非镇静抗组胺药，通过代谢为卡瑞斯汀发挥效应，多项研究表明依巴斯汀除了其抗组胺作用外，该药对过敏性炎症也具有治疗作用[2]。体外实验中依巴斯汀通过抑制T细胞分泌Th2型细胞因子提示其可能有助于治疗AD等以Th2型免疫反应为主的疾病[3]。本研究以 DNFB 致敏后的BABL/c小鼠作为AD动物模型的研究对象，使用依巴斯汀治疗AD小鼠，评价和探讨依巴斯汀对特应性皮炎的抗炎作用。

1 材料

1.1 实验动物 SPF级Balb/c雌性小鼠18只，6～8周龄，体重18～20 g，动物合格证号：SCXK(川)2020-030，由成都达硕实验动物有限公司提供。购入后于实验室适应性饲养1周。

1.2 主要试剂与仪器 2，4-二硝基氟苯(上海麦克林生化科技有限公司)；依巴斯汀片(江苏联环药业股份有限公司)；小鼠白细胞介素4 酶联免疫吸附法试剂盒(Elabscience)；酶标检测仪(BioTeK，型号Epoch)；光学显微镜(日本奥斯巴林公司)。

2 方法

2.1 分组 将18只小鼠随机分为空白组6只(正常对照组)，阴性对照组6只(DNFB +生理盐水组)，治疗组6只(DNFB+依巴斯汀组)。

2.2 造模 实验前一天用电动剃毛刀剔除小鼠背部毛发(面积约1.5 cm×2.5 cm)，用胶带反复粘贴背部剃毛区域破坏皮肤屏障。实验第一周的第1天和第2天用移液枪移取100 μL 0.5% DNFB溶液(丙酮/橄榄油=3∶1)，均匀涂抹于治疗组及阴性对照组小鼠背部已剃毛区域。从第二周开始，以每周2次(每次间隔约3天)的频率将100 μL 0.2% DNFB溶液(丙酮/橄榄油=3∶1)均匀涂抹于已致敏小鼠背部，连续3周，共4周。

2.3 给药 本研究小鼠每日使用依巴斯汀剂量(4.1 mg/kg)是根据成人每日最大治疗剂量(20 mg)来确定的[4]。从实验第3周开始，治疗组小鼠每只予以0.2 mL依巴斯汀生理盐水悬浊液(0.41 mg/mL)灌胃，阴性对照组小鼠予以等量0.2 mL生理盐水灌胃。见图1。

2.4 观察指标

2.4.1 体重测量 在实验开始与结束时对每只小鼠进行称重，并计算每只小鼠的体重变化。

2.4.2 背部皮损评分 对治疗前后治疗组及阴性对照组皮损进行评分[5，6]：(1)红斑/出血；(2)表皮剥脱/糜烂；(3)水肿；(4)干燥/鳞屑。每种表现的打分范围均为0～3分：0分(无)、1分(轻度)、2分(中度)、3分(重度)。症状处于两种分值之间记0.5，总分值12分。

2.4.3 搔抓 测量并记录了最后一次DNFB激发后小鼠10 min的搔抓次数，作为小鼠的抓挠行为的评价指标。

2.4.4 组织病理学观察 对小鼠皮损组织行石蜡包埋切片、HE染色，观察每组小鼠皮损表皮厚度及嗜酸粒细胞数目的浸润情况，计算每只小鼠10个高倍视野(400倍)下嗜酸粒细胞的总数目。

2.4.5 血清IL-4的检测 实验结束时小鼠眼球摘除法取血并分离血清，参照ELISA说明书检测血清IL-4水平。

小鼠给药2周皮损变化：1a和1b，空白组给药前后；1c和1d，治疗组给药前后；1e和1f，阴性对照组给药前后

3 结果

3.1 小鼠体重 治疗组及空白组小鼠体重在实验结束时较前明显增长(P<0.05)，阴性对照组体重无明显变化(P>0.05)。实验期间治疗组及空白组小鼠的体重增长较阴性对照组明显(P<0.05)，见表1。

表1 小鼠体重情况

3.2 皮损评分 计算给药前后每只小鼠皮损评分差值以代表皮损改善情况。给药前治疗组(8.917±0.9704)和阴性对照组(8.667±0.2582)皮损评分相比无统计学差异，治疗组给药后皮损评分(6.417±1.242)较阴性对照组(8.000±0.5477)明显降低(P<0.05)，治疗组给药前后皮损评分差值(2.500±1.265)与阴性对照组(0.6667±0.7528)相比相差更大(P<0.05)。

3.3 搔抓情况 在最后一次DNFB激发后，治疗组小鼠的10 min的搔抓次数(20.25±13.91)较阴性对照组小鼠的搔抓次数(52.75±15.09)减少，差异具有统计学意义(P<0.05)。

3.4 皮损病理 实验结束取小鼠背部皮损行组织病理学检查，比较每组小鼠的表皮厚度与嗜酸粒细胞总数。与空白组表皮厚度(15.55±2.481)μm和嗜酸粒细胞计数(13.17±4.875)相比，阴性对照组小鼠皮损处表皮(108.7±29.30)μm明显增厚(P<0.001)，嗜酸粒细胞数量(152.5±21.39)明显增多(P<0.001)；与阴性对照组相比，治疗组模型小鼠皮损处的表皮厚度(71.49±16.22)μm及嗜酸粒细胞浸润(92.00±9.487)明显改善见图2、3。

3.5 血清IL-4水平 与空白组(72.74±40.04)pg/mL相比，阴性对照组(152.0±59.39)pg/mL小鼠血清IL-4明显升高(P<0.05)；治疗组(82.01±26.53)pg/mL与阴性对照组相比血清IL-4明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。

治疗组(2a)嗜酸粒细胞较阴性对照组(2b)明显减少；2c：空白组

治疗组(3a)表皮厚度较阴性对照组(3b)明显改善；3c：空白组

4 讨论

特应性皮炎是一种由多因素引起、以剧烈瘙痒和湿疹样损害为特征的常伴特应性体质的炎症性皮肤病，严重影响患者生活质量。其确切病因不明，目前认为Th2细胞的异常激活并产生Th2型免疫反应应答是AD发病的免疫学基础[7]。其中IL-4是Th2型免疫反应的标志性细胞因子，IL-4水平升高会引起AD症状，是AD发病的主要分子，因此IL-4是AD治疗的重要靶点[8,9]。

临床上抗组胺药常作为AD患者的辅助治疗，虽然一些研究表明部分抗组胺药在AD动物或患者体内有一定疗效，但由于其实验证据尚不充分，不同国家及地区对于是否使用抗组胺药治疗AD的意见不一[10]。依巴斯汀作为第二代抗组胺药，具有良好的安全性，不仅能减轻AD患者的皮损表现和血清中的嗜酸粒细胞水平，还能降低血清Th17比例及IL-17表达，改善炎症状态[11,12]。研究表明，依巴斯汀抑制淋巴细胞IL-4、IL-5等细胞因子的表达，降低慢性荨麻疹、过敏性鼻炎患者血清中IL-4水平，可能有助于治疗以Th2型免疫反应为主的疾病[3,13-15]。而本研究结果亦表明依巴斯汀能抑制AD小鼠血清中IL-4的水平，对AD小鼠体内Th2型免疫可能有抑制作用。

皮肤组织中嗜酸粒细胞的数量可反映皮损的炎症情况，皮肤厚度可用来评估AD的治疗效果[16]。本实验经依巴斯汀治疗的AD小鼠皮损组织中嗜酸粒细胞浸润减少，表皮厚度改善。既往抗组胺药对AD小鼠的治疗研究中，盐酸奥洛他定可减轻小鼠的皮肤炎症、瘙痒及相关细胞因子的水平[17]。氯雷他定与非索非那定可改善与AD有关的瘙痒，非索非那定亦降低AD小鼠血浆中组胺及嗜酸粒细胞趋化因子水平[18,19]。本研究结果显示，依巴斯汀可能是通过抑制Th2型免疫反应及减少皮损内嗜酸粒细胞的浸润，缓解AD小鼠的皮肤炎症和瘙痒症状，进而改善AD小鼠的生长。依巴斯汀对AD患者的疗效及机制还有待进一步研究。本研究为依巴斯汀治疗AD提供了一定的理论基础。