Rothmund-Thomson综合征一例基因检测分析

邸文柯 赵 晴 王真真 付希安 孙乐乐 于功奇 刘 红 张福仁

山东第一医科大学附属皮肤病医院(山东省皮肤病医院)，山东省皮肤病性病防治研究所，济南，250022

Rothmund-Thomson综合征(RTS)是一种常染色体隐性遗传病，主要表现为皮肤异色症、身材矮小、毛发稀疏、青少年白内障、骨骼异常、早衰倾向，并易发生肿瘤，特别是骨肉瘤[1]。RTS于1868年由德国眼科医生Rothmund最先描述；1936年，英国皮肤科医生Thomson报道了3例类似的患者；1957年，Taylor将其定义为Rothmund-Thomson综合征。RTS是一种罕见的疾病，目前共报道400余例[2]。根据RTS的临床表现及致病基因，RTS可分为两种类型，Ⅰ型RTS主要表现为皮肤异色症、外胚层发育不良及青少年白内障，由ANAPC1基因突变所致[3]；而Ⅱ型RTS以皮肤异色症及骨骼异常为特征，其致病基因为RECQL4。研究发现约60%的RTS患者携带RECQL4基因突变，10%的患者携带ANAPC1基因突变，另有30%的患者未找到突变。RECQL4基因属于RecQ DNA解旋酶家族，在维持基因组的完整性和稳定性中发挥重要作用，包括DNA的复制、转录及损伤后修复[4]。迄今，约70个RECQL4基因上的突变位点被报道与RTS相关[5]。

我们收集了1个RTS家系，通过全外显子组测序(whole exome sequencing, WES)进行突变检测，发现RECQL4基因上携带复合杂合突变，并对已报道的RECQL4基因突变位点进行了文献回顾。

1 对象与方法

1.1 研究对象 在山东第一医科大学附属皮肤病医院门诊收集的一个家系。先证者，女，5岁。自幼面颊部出现暗红色、褐色斑片，随后部分皮损发展成网状点状色素沉着及萎缩性色素脱失斑；随后皮损渐增多，累及躯干、臀部，对称分布(图1)；伴光敏。患儿自幼身材矮小，体重较同龄儿轻，发育迟缓。无骨骼发育畸形、先天性白内障等并发症。患儿父母均体健，否认近亲结婚。初步诊断为Bloom综合征。为进一步明确诊断及确定致病基因，进行WES测序。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA提取 本研究经山东省皮肤病性病防治研究所伦理委员会批准，在签署知情同意书后，抽取患儿及父母外周血各2 mL，-80℃保存。利用DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)提取基因组DNA，利用全波长紫外/可见光扫描分光光度计ND-8000(Thermo Fisher，美国)测定其浓度及纯度，并将其标化为30 ng/μL的DNA模板。

1.2.2 全外显子测序 基因组DNA经Bioruptor Pico超声破碎仪随机打断成长度为150～200 bp的片段进行建库，所构建的文库浓度需大于25 ng/μL。使用Illumina NovaSeq 6000平台进行测序。利用FastQC进行质控。利用BWA v0.7.17软件将测序结果与参考序列hg39进行比对，再利用GATK v4.0.12.0对结果进行进一步过滤。

1.2.3 Sanger测序 利用Sanger测序对WES结果进行验证。利用NCBI网站(www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)进行引物设计，后合成引物(华大基因科技有限公司，北京)。利用设计的引物通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)对RECQL4基因相应的外显子进行扩增。利用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，并通过醋酸钠乙醇沉淀法对PCR产物进行纯化。随后，进行测序PCR反应，并利用ABI 3500XL基因分析仪对纯化后的测序PCR产物进行测序。

1.2.4 突变分析 通过1000 Genomes Project、Exome Aggregation Consortium及gnomAD数据库对WES中发现的突变进行过滤。利用SIFT、polyphen2对突变进行预测，并在已有的364个内部对照中进行验证。利用Chromas软件对Sanger测序结果进行分析，并经NCBI blast数据库进行分析对比。

2 结果

先证者的WES测序发现其在RECQL4基因上携带复合杂合突变，其中一个为在第1579位插入一个碱基腺嘌呤(c.1579dupA)，造成移码突变(p.T527fs)，另一个为第2290位胞嘧啶突变为胸腺嘧啶(c.2290 C>T)，导致第764位氨基酸由谷氨酰胺变为终止密码子(p. Q764X)。上述两个突变在三个公共数据库(1000 Genomes Project、Exome Aggregation Consortium及gnomAD)中均未见报道，且上述突变在我们已有的364个内部对照中均未被发现。通过Sanger测序证实该患儿携带RECQL4基因上的复合杂合突变，其中突变c.1579dupA来自患儿的母亲，c.2290 C>T来自患儿父亲(图2)。通过查阅文献，目前共报道78个RECQL4基因的突变与RTS相关(图3)。

图1 面部(1a、1b)、腹部(1c)及臀部(1d)可见对称分布的色素沉着斑及色素减退斑

2a、2b：先证者；2c：先证者母亲；2d：先证者父亲

图3 Rothmund-Thomson综合征RECQL4基因突变谱，红色字体为本例患儿携带的突变

3 讨论

1999年，Kitao等[6]首次通过候选基因研究发现RTS患者携带RECQL4基因突变。RECQL4基因于1998年被首次报道[7]，位于8号染色体长臂24.3，是RecQ解旋酶家族成员之一。除RTS外，RECQL4基因突变还与Baller-Gerold综合征及RAPADILINO综合征相关[8]。Baller-Gerold综合征主要表现为骨骼发育不良、身材矮小及颅缝早闭；RAPADILINO综合征以骨骼异常为特点，而没有皮肤异色症的表现[9]。因此，通过患者的临床表现，不难区分。目前，已发现超过100个RECQL4基因的突变与上述三种疾病相关[5]。

RECQL4蛋白由1208个氨基酸组成[5]，可分为不同的结构域，与RecQ解旋酶家族中的其他成员相比较，RECQL4蛋白中的超家族Ⅱ解旋酶结构域(SF2)为家族成员所共有，其氨基端和羧基端为RECQL4蛋白特异的。RECQL4蛋白氨基端存在Sld2样结构域，可参与DNA复制起始，研究发现，敲除Recql4基因的小鼠将在胚胎时期死亡[10]，而保留Recql4基因氨基端，小鼠可以存活。此外，RECQL4包含两个核定位信号区域，其中一个位于RECQL4蛋白的起始部位，为线粒体定位信号，与该蛋白在线粒体中的定位相关；另一个位于第420位氨基酸及第463位氨基酸之间的区域，与该蛋白从线粒体上释放相关，因此，RECQL4也参与线粒体DNA的合成。RECQL4蛋白在DNA损伤修复中发挥关键作用，其中第363位氨基酸至第492位氨基酸区域在RECQL4蛋白募集至DNA损伤区域发挥重要作用，并可与BLM蛋白相互作用。BLM不会影响RECQL4募集，但可影响RECQL4在DNA损伤区域的停留，同时，RECQL4也可提高BLM活性。此外，第470位氨基酸至第820位氨基酸构成的SF2结构域及RECQL4蛋白的羧基端也参与DNA损伤修复。RECQL4蛋白包括两个锌结合区域，其中一个为第397位氨基酸至第421位氨基酸区域，另一个为其羧基端第836位氨基酸至第1044位氨基酸之间的区域。综上，可以看出RECQL4蛋白可通过不同功能域发挥独特的功能，其编码基因上不同的致病突变可导致其不同的功能受损。但当变异发生在RECQL4蛋白的氨基端，可影响该蛋白在DNA复制起始中的作用，是致死性的，因此，尚未有该结构域纯合突变的报道[11]；而当致病变异发生在SF2结构域，虽然变异对RECQL4蛋白有害，但可存活，在目前报道的与RTS相关的RECQL4基因上的致病突变，约60%位于SF2结构域。本例患儿携带的两个突变，其中，突变位点c.2290 C>T已被报道[2]，而 c.1579dupA尚未有报道，这两个突变位点均位于SF2结构域，因此，可能影响RECQL4蛋白参与DNA损伤修复。

RTS患者有不同的临床表型，当患者未发生肿瘤时，其预期寿命不会被影响。因此，建立RTS患者致病突变与是否会发生肿瘤之间的联系尤为重要。2003年，Wang等[12]对33例临床诊断为RTS患者的RECQL4基因进行分析，其中23例患者携带该基因的突变。同时，在33例RTS患者中，11例发生骨肉瘤。通过基因型-表型分析发现，携带可造成RECQL4截短蛋白突变的患者发生骨肉瘤的风险明显升高。2018年Colombo等[11]报道携带非解旋酶结构域突变的患者的临床表现通常较轻，主要表现为皮肤异色症，而携带解旋酶结构域突变的患者更容易发生肿瘤。本例患儿携带的两个突变均位于RECQL4蛋白的解旋酶结构域，其中，突变c.2290 C>T可形成截短蛋白，既往报道的携带该突变的患儿表现为臀部及四肢的皮肤异色，睫毛和眉毛的缺失，未有肿瘤的发生，而本例患儿除表现为躯干皮肤异色外，伴有发育迟缓，尚未发现有肿瘤的发生，应当对患者进行密切监测。

目前，RTS尚无统一的诊断标准。Wang等[13]提出，当患者出现头发、眉毛、睫毛的稀疏，身材矮小，先天性骨骼发育异常，牙齿和指甲异常，皮肤异色症，白内障和肿瘤时，应考虑RTS的可能。Pujol等[14]则认为，当患者同时出现骨肉瘤和皮肤异色症的表现时，应高度怀疑是否为RTS。同时，在出现特征性表现的患者中应进行RECQL4基因的检测。本例患儿在初诊时诊断为Bloom综合征。Bloom综合征是一种罕见的常染色体隐性遗传病，其致病基因为RecQ解旋酶家族中的BLM基因[15]。Bloom综合征的患者通常在出生时表现为面部红斑；2岁后，可表现出光敏性，并出现面部蝶形红斑；此外，在躯干和四肢可以见到色素沉着和色素减退斑。同时，患者易发生感染，其发生肿瘤的风险较正常人高150～300倍。RTS与Bloom综合征的临床都可表现为面部红斑、身材矮小等，但通过基因检测可对二者进行鉴别[16]。

本文报道一个RTS家系，通过WES及Sanger测序发现患儿在RECQL4基因上携带一个移码突变(c.1579dupA)和一个无义突变(c.2290 C>T)，其中c.1579dupA未被报道。因此，本研究丰富了疾病基因库，也为该家系的遗传咨询提供帮助。