基于ICP-MS结合化学计量学的不同品牌酱香型白酒鉴别方法

卓俊纳,吴卫宇,何霜,赵金松,3*

1(四川轻化工大学 生物工程学院,四川 宜宾,644000) 2(四川国检检测有限责任公司,四川 泸州,646000)3(四川省酒业集团有限责任公司,四川 泸州,646500)

白酒是我国特有的传统酒种，与白兰地、威士忌、伏特加、金酒、朗姆酒合称为世界六大蒸馏酒[1]，它拥有独特的酿造工艺和独特的酒体风味，因此深受消费者的喜爱。其中，酱香型白酒是中国传统白酒的代表之一[2]，由于其“2次投粮，9次蒸煮，8次发酵，7次取酒”的特殊酿造工艺[3-4]造就了其“酱香突出、幽雅细腻、酒体醇厚、回味悠长、空杯留香持久”的风味特点[5-6]。近年来，酱香型白酒的市场规模不断扩大。随着人们对白酒的深入研究，白酒中的无机元素越来越受到人们的重视[7]。无机元素与白酒的品质息息相关，且会对引用者的身体健康造成影响[8-10]。无机元素含量过高不仅会影响白酒的色泽、口感，且会对人体的身体机能形成一定干扰和影响，造成慢性中毒，危害健康[11]。GB 2762—2017《食品安全国家标准 食品中污染物限量》对白酒中的铅有了更低的限量(0.5 mg/kg)。白酒中无机元素主要有两种，一是原料谷物种植过程中，受空气、土壤等因素的影响而出现的无机元素；二是酿酒生产过程中，水源、酿酒设备以及储存容器带入白酒的无机元素，造成白酒重金属的污染[12]。

检测白酒中无机元素的方法有原子吸收光谱法[13]、原子荧光光谱法[14]、电感耦合等离子发射光谱[15]、电感耦合等离子体质谱法(inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)[16]等，其中ICP-MS可针对不同元素予以测定，且此法操作简单，测定速度较快，精准度较高，能够进行同位素分析和有机物中金属元素的形态分析[17]，可全面应用于环境[18]、食品[19]检测乃至法庭科学[20]等行业。随着检测技术的不断成熟，需根据不同待测物找到有效的数据处理和分析方法。郭金喜等[21]利用ICP-MS/MS测定新疆黑枸杞红酒22种微量元素，并对3种新疆黑枸杞红酒15个样品进行分析，提取其中的5种成分来评判新疆黑枸杞红酒中微量元素的分布。杨雯懿等[1]采用ICP-MS/MS测定4个地区18种白酒中14种元素的含量，并结合主成分分析(principal component analysis，PCA)和聚类分析(hierarchical cluster analysis，HCA)完成对白酒类别的初步甄别，不同地方酿造的白酒无机元素含量差异显著。综上所述，利用检测技术结合化学计量学能对数据隐含的更深层次的信息进行有效挖掘和分析[22]。

本实验以4个不同品牌的52种酱香型白酒为研究对象，采用ICP-MS检测白酒中16种无机元素的含量，并结合HCA、PCA以及偏最小二乘判别分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)等办法分析不同品牌酱香型白酒中无机元素的差异，可为酱香型白酒快速分类以及鉴别提供科学有效的技术手段。

1 材料与方法

1.1 样品、试剂与仪器

1.1.1 样品

4个品牌共计52个酒样,包括仙潭酒业酒样11个(X1～X11);羽丰酒业酒样11个(Y1～Y11);普照酒业酒样13个(P1～P13);红军杯酒业酒样17个(H1～H17);验证酒样2个(Z1、Z2,均为普照酒业酒样),所有酒样均由相应酒厂提供。

1.1.2 试剂与仪器

试剂：Ca、Na、K、Mg、Cu、Fe、Mn、Zn、Sr、Al、As、Cd、Cr、Ni、Pb和Se单元素标准溶液,国家有色金属及电子材料分析测试中心;硝酸(65%分析级),德国Merck公司;超纯水(18.2 MΩ),实验室自制。

仪器：ICP-MS NexION2000电感耦合等离子体质谱仪,美国PE公司;MARS 6微波消解仪,美国CEM公司;SIGMA 3-18KS高速离心机、BS224S万分之电子天平,赛多利斯;DZF—6090真空干燥箱,上海一恒科学仪器;超纯水机,美国Milli-Q公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品预处理

吸取5 mL酒样于微波消解管,然后再将其放入石墨赶酸器中蒸发,蒸发温度80 ℃。当蒸发剩余2 mL时,继续加入5 mL的硝酸,盖好盖子保存1 h,按照表1中的参数进行微波消解。

表1 微波消解程序Table 1 Microwave digestion program

消解完成后置于超声水浴中放置10 min,再用超纯水定容至50 mL,摇匀备用。同时做空白试验。

1.2.2 ICP-MS工作条件

检测样品前使用1 μg/L的调谐液调谐仪器,满足仪器程序要求的灵敏度、背景、氧化物、双电荷和稳定性指标,调谐后ICP-MS的工作参数为：RF功率1 250 W,雾化器流量0.97 L/min,辅助气流量1.2 L/min,等离子体气流量15 L/min,采样深度0 nm,样品锥孔径0.88 mm,截取锥孔径1.1 mm,超截取锥孔径1.0 mm,采集驻留时间50 ms,雾室温度2 ℃,采集次数3次。

1.2.3 测定方法

为了消除质谱干扰,本文采用氨气反应模式(NH3DRC)和氦气碰撞模式(He KED)消除干扰,并通过在线加入72Ge、103Rh、185Re作为内标,分区段监测多元素的质谱行为。鉴于各元素本身特征与浓度等存在显著差距,故将K、Na、Ca、Mg、Al配成一组混标,系列质量浓度为：0、0.2、1.0、5.0、10.0、15.0、20 mg/L。Cu、Fe、Mn、Zn、Sr配成一组混标,系列质量浓度为：0、0.05、0.20、0.6、1.0、1.5、2.0 mg/L。As、Cd、Cr、Ni、Pb、Se配成一组混标,系列质量浓度为：0、0.5、2.0、5.0、10.0、25.0、50.0 μg/L。

1.3 数据统计与分析

1.3.1 原始数据标准化

对原始数据进行z-score标准化。将原数据减去该变量的平均数,然后除以该变量的标准差。以消除原始数据间的量纲影响,使数据更具可比性。

1.3.2 数据分析

利用SPSS 24.0、SIMCA 14.1对数据进行化学计量学分析,Excel 2013、Origin 2021软件对测定数据进行整理统计和画图分析。

2 结果与分析

2.1 白酒样品元素的测定

采用ICP-MS测定样品中Al、Ca、Fe、K、Mg、Na、Pb、As、Cd、Ni、Cr、Se、Cu、Mn、Sr、Zn等16种主要元素的含量,具体数据见表2,箱型图见图1。由于品牌不同,各酒样无机元素含量也不同,为确保最终数据的科学性与精准性,首先需要对这些数据进行标准化处理。

表2 各品牌白酒元素浓度范围 单位：μg/L

图1 52组白酒样品中的元素含量箱形图Fig.1 Box plot of elements content in the 52 analyzed Baijiu samples

2.2 PCA

PCA可借助线性变换法得出最少个数的综合变量，达到降维的目的，其信息损失量少，能在保证信息完整度的前提下，支持多个指标的转化和同步分析。每个主成分都是原始变量的线性组合，且各主成分间不相关[23]。

2.2.1 无机元素的相关性分析

使用相关系数矩阵对数据进行适应性检验,从表3可以看出16种无机元素呈显著正相关,表明酒样中的无机元素间的相关性较强,能用PCA方法对其进行处理。

2.2.2 无机元素的因子分析

在PCA的前提下,采集公因子,并针对性的展开分析,具体数据见表4。以累积方差贡献值>80%且特征值>1为原则,选择公因子数为3个时,累计方差贡献率为82.776%,16种元素的有关参数都显示在其中,选择前3个主成分,并基于这一结果对52种酒样的分布规律予以说明。

表3 白酒中无机元素的相关性矩阵Table 3 Correlation matrix of inorganic elements in Baijiu

表4 PCA特征值和总体方差描述Table 4 Principal component analysis characteristics and total variance explained

以主成分PC1为X轴,分别以PC2、PC3为Y轴,建立每个白酒样品的得分图(图2)。

a-PC1,PC2;b-PC1,PC3图2 不同品牌酱香型白酒PCA散点图Fig.2 PCA scattering plot of Maotai-flavor Baijiu

由图2-a所示,羽丰酒业酒样分布在第4象限,与仙谭、普照、红军杯酒业相比差异明显,但其点相对离散,在主成分1上的得分范围较广。红军杯酒样的分布集中在第3象限,且点相对聚集,与其余3个品牌的酒样区分明显。羽丰与普照酒业酒样均分布在第1、2象限,虽然其分布存在部分交叉,但也能较好区分。如图2-b所示,4种品牌白酒能够有效区分,但其区分度不及图2-a。虽然普照被仙谭、羽丰、红军杯从3个方向包围,但是在图中并没有交点,也能较好的分类预测。因为前3组分的方差贡献率为82.776%,解释了4种品牌白酒样品的大部分差异,所以PCA能将4种品牌白酒有效区分。

2.3 HCA

HCA是基于样本数据自带的相似度的基础上自发汇聚的一种技术,是一种无监督模式识别方法[24]。采用SPSS 24.0对不同品牌的52种白酒样品进行HCA。然后,基于欧氏距离平方为测量准则,得出的详细HCA结果显示(图3),4个品牌的52个酱香型白酒分为2大类和6个小类。

由于白酒中各元素浓度受较多因素影响,同一品牌,不同品种、批次样品的无机元素含量也存在差异,因此个别酒样(P1、P3、P4、Y3)被单独分类,但是绝大部分酒样能按照品牌单独聚集为一类,表明不同品牌白酒之间无机元素的含量存在较大差异,因此以16种元素为原始变量可以将不同品牌酱香型白酒进行正确归类,PCA和HCA可以相互验证。

图3 白酒中无机元素含量系统聚类Fig.3 Phylogenetic clustering of Baijiu based on inorganic elements

2.4 PLS-DA

变量之间的关联使得研究难度不断提高。而相比于其他回归模型的特征以及参数，PLS-DA对于其他变量的兼容性较强，因此能够将有共线性的数据同步归类与建模。不仅如此，当样本数量低于变量数量时，仍然有着很高的操作性，而且在辨识度方面也更具优势[25]。

由图4可见,PLS-DA能够有效区分不同品牌酒样,X轴的负半轴酒样皆来自羽丰酒业,Y轴正半轴酒样皆来自仙谭酒业,普照酒业酒样明显集中于第4象限,且酒样散点距离较远,红军杯酒业酒样明显集中于第1象限,且散点分布集中。结果表明,PLS-DA散点图能够更加直观、准确地区别不同品牌的酱香型酒样,其分类结果与HCA、PCA结果相似,都对研究样品进行有效鉴别和分类。

图4 不同品牌酱香型白酒PLS-DA散点图Fig.4 PLS-DA scatter plot in different brands of Maotai-flavor Baijiu samples

2.5 不同品牌酱香型白酒无机元素含量差异原因分析

本次试验利用16种共有无机元素,多种化学计量学方法能将4个不同品牌的酒样有效分类。同时,在HCA、PCA和PLS-DA中,52个酒样按照品牌进行了很好地分类,造成这种现象的原因可能有以下几个方面:(1)酿酒原料不同[26]。由于酱香型白酒“高温制曲、高温堆积、高温发酵、高温馏酒以及生产周期长、贮存期长、用曲量大”的独特酿造工艺[5],在生产过程中会使酿酒原料(粮食、水等)中特有的无机元素保留在酒体中。不同酿酒原料中所含的无机元素种类及含量均不同,因此同一香型的白酒,就算生产工艺相同,使用原料不同也会造成酒样中无机元素的含量不同。(2)生产设备不同[27]。生产设备的常规金属元素(Fe、Al等)以及部分重金属(Pb、Cr等)会迁移进入酒体。白酒生产过程中连接管、冷凝管等设备的材料多种多样(锡、铝、不锈钢等)，也可能影响白酒中的无机元素含量。(3)储存容器不同[28]。白酒在贮存过程中,容器中的金属元素也会不同程度地进入酒体,影响白酒品质。不同酒厂储存白酒的容器各不相同,如红军杯酒业主要是不锈钢罐储存,而仙谭酒业主要使用陶坛罐与不锈钢罐,因此造成了不同品牌酒样中无机元素含量的差异。

2.6 方法验证

为进一步探究不同品牌酱香型白酒中无机元素的差异,利用重要性因子(variable importance projection,VIP)值量化无机元素对酒样分类的贡献,筛选重要特征物质。VIP值是PLS-DA模型变量的变量权重值,可用于衡量各代谢物积累差异对各组样本分类判别的影响强度和解释能力,VIP≥1为常见的差异代谢物筛选标准[29]。图5为酱香型白酒无机元素的VIP值分布图,VIP值越大,该无机元素对不同品牌酱香型白酒差异贡献越大。

图5 酱香型白酒无机元素的VIP值Fig.5 VIP value of inorganic elements in Maotai-flavor Baijiu samples

为筛选对不同品牌酱香型白酒差异具有重要贡献的无机元素,筛选贡献度较大、VIP>1的4种无机元素进行分析,包括Na(2.352 31)、Ca(1.874 76)、Al(1.652 26)、K(1.291 57)。基于ICP-MS结合化学计量学建立的不同品牌酱香型白酒区分模型,将样品Z1、Z2作为验证酒样,测定Z1、Z2中VIP>1的4种无机元素(Na、Ca、Al、K)的含量,结果见表5。

表5 验证酒样无机元素质量浓度 单位：μg/L

将验证酒样的无机元素数据带入进行分析,结果如图6所示,淡蓝色点即为验证酒样。结果表明,虽然验证样品Z1、Z2只有4个无机元素数据,但仍然能与普照酒业酒样很好地归类到一起。本方法能够快速、准确地对不同品牌酱香型白酒进行识别,也说明不同品牌酱香型白酒中的无机元素含量具有一定的分布规律且能够通过本方法进行辨别。

图6 验证酒样PLS-DA散点图Fig.6 PLS-DA scatter plot for verifying Baijiu samples

3 结论

本文采用ICP-MS测定了4种品牌52个白酒样品中的16种元素含量。分析数据经z-score标准化后,对所有样品进行HCA、PCA和PLS-DA。HCA、PCA能将4个不同品牌的酒样进行有效分离。以52种酒样的16种无机元素含量数据建立PLS-DA模型,所建立的模型也能将4个品牌的酒样区分开。结合VIP值对造成差异性的关键无机元素进行分析,发现Na、Ca、Al、K等是造成不同品牌酱香型白酒差异性的主要无机元素,且在方法验证中验证酒样与实验酒样也能很好的按照品牌归类,表征了不同品牌酱香型白酒无机元素差异性。因此,利用ICP-MS的检测技术结合多种化学计量学分析方法能对不同品牌的酱香型白酒进行有效的分类和鉴定,且建立的PLS-DA模型能使分类与鉴定更加快捷与高效。