热加工对牡蛎中锌元素存在形态的影响

钟润芳,曹文红,2,3*,陈忠琴,2,3,何梅芳,高加龙,2,3,章超桦,2,3,秦小明,2,3,郑惠娜,2,3,林海生,2,3

1(广东海洋大学 食品科技学院，广东 湛江，524088) 2(国家贝类加工技术研发分中心，广东省水产品加工与安全重点实验室，广东省海洋生物制品工程实验室，广东省海洋食品工程技术研究中心，水产品深加工广东普通高等学校重点实验室，广东 湛江，524088)3(大连工业大学海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心，辽宁 大连，116034)

锌是人体重要的必需微量元素之一,在人体内具有多种生物学功能[1-4]。它参与物质代谢,对维持机体生理功能和正常代谢起着重要作用。一般情况下,人体对于锌的吸收和排泄处于动态平衡状态,锌缺乏或过量都会引起多种相关疾病[5-6],维持这种稳态对于机体代谢至关重要。食源性锌的吸收利用情况主要取决于锌的含量及其生物利用率,而锌的生物利用率取决于其化学形态;锌元素在生物体内主要以无机锌和有机锌的形式存在[7],已有研究表明有机锌的生物利用率高于无机锌[8],且锌与多糖、蛋白结合后,生物活性增强[9]。因此研究生物体中锌元素的存在形态,有利于探索其营养价值。

据《中国食品成分表》显示,水产品中贝类锌含量尤为丰富,特别是牡蛎,其含锌量高达9.39 mg/100 g(生鲜)[10]。目前我国的牡蛎除少部分用于加工成牡蛎高值化产品外,大部分还是直接生鲜食用,不同的烹饪方式不仅能改变食物的质地、柔软度和味道等特征,还可导致牡蛎中不同营养物质化学形态发生变化,从而影响营养物质的消化吸收[11]。目前关于牡蛎热加工处理对锌元素的影响,主要集中于其总含量的变化,而热加工对牡蛎中锌元素的存在形态、有机锌结构变化尚未有研究报道。因此本研究选择蒸制、油炸和烤制3种常见热加工方式,研究牡蛎经过热加工后锌元素含量及存在形态的变化,为牡蛎中锌元素的营养评价提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

香港牡蛎,购于湛江水产批发市场,11月份采集,其长度为(12.8±0.6)cm,宽为(6.0±0.4)cm。

食用油,山东鲁花集团有限公司;扇贝成分分析标准物质(GBW10024),物理地球化学勘查研究所;锌元素标准溶液,美国Agilent科技公司;本实验所用试剂除硝酸、过氧化氢为优级纯外,其余均为分析纯。

1.2 仪器与设备

PRO4121V756型微波消解仪,奥地利Anton Paar Multiware PRO公司;Thermo M6型火焰原子吸收分光光度计,美国Thermo Fisher公司;FDU551型冷冻干燥机、N-1100V-WB型旋转蒸发仪,日本东京理化器械株式会社;BRUKER TENSOR 27型傅里叶红外光谱仪,德国Bruker公司;VOPADEST450型全自动凯式定氮仪,中国广州德资格哈特仪器有限公司;Cary 60 UV-Vis型分光光度计,美国Agilent公司;T18 digital ULTRA-TURRAX型均质机,德国IKA仪器设备有限公司。

为避免污染,本实验所用玻璃器皿均经过20%硝酸浸泡24 h以上,用自来水、蒸馏水和超纯水分别清洗3次,并在使用前保持干燥。

1.3 实验方法

1.3.1 牡蛎热加工处理

牡蛎经开壳后,取肉,超纯水快速冲洗3遍,随机分为4组：生鲜组(不经热处理)、蒸制组(100 ℃、10 min)、油炸组(140 ℃、5 min)、烤制组(200 ℃、15 min),其中油炸组以花生油作为介质,烤制组带半壳烤箱烤制;冷却后,使用搅拌机将其匀浆,确保样品的均一性和代表性,处理后立即冷冻干燥,分袋真空包装,-20 ℃贮藏备用。

1.3.2 锌含量的测定

采用微波消解-原子吸收分光光度法测定锌含量;锌离子含量采用AAT Bioquest公司的AmpliteTMColorimetric Zinc Ion Quantitation Kit试剂盒测定。

1.3.3 锌离子的提取

称取约0.5 g样品冻干粉,按1∶25料液比加入125 mL超纯水,均质(8 000 r/min)1 min,离心(8 000 r/min) 10 min,取上清液,沉淀再次重复2次以上操作,合并上清液并定容至100 mL,用于测定锌离子的含量。

1.3.4 含锌多糖组分的提取

称取约5 g样品冻干粉,按1∶25料液比加入125 mL超纯水,室温摇床浸提3 h,离心,沉淀再次重复以上操作,合并上清液,浓缩,Sevag法重复4次除蛋白,加入4倍体积无水乙醇,4 ℃沉淀14 h,离心收集沉淀,冷冻干燥后粉末即为牡蛎水溶性含锌粗多糖组分。将上述提取残渣加入10倍体积的质量分数为3% NaOH,室温摇床提取2 h,离心,重复提取1次,上清液用稀盐酸中和至中性,浓缩,透析(MWCO 3.5 kDa),醇沉,离心收集沉淀,冷冻干燥后粉末即为牡蛎碱溶性含锌粗多糖组分。

1.3.5 含锌蛋白组分的提取

称取约5 g样品冻干粉,按1∶25料液比加入125 mL磷酸盐缓冲溶液A(0.05 mol/L pH 7.4 PBS),冰浴间歇均质1 min,4 ℃摇床提取2 h,离心,收集上清液,沉淀再次加入125 mL磷酸盐缓冲溶液A,共重复提取3次,合并上清液,饱和硫酸铵沉淀蛋白,静置过夜,离心,沉淀复溶,透析除盐(MWCO 3.5 kDa),冷冻干燥后粉末即为水溶性含锌粗蛋白组分。将上述提取残渣加入125 mL磷酸盐缓冲溶液B(0.1 mol/L pH 7.4 PBS,I=1.0 NaCl)混匀,4 ℃摇床提取10 h,离心,收集上清液,沉淀再次加入125 mL磷酸盐缓冲溶液B,重复提取2次,合并上清液,饱和硫酸铵沉淀蛋白,静置过夜,离心,沉淀复溶,透析除盐(MWCO 3.5 kDa),冷冻干燥后粉末即为盐溶性含锌粗蛋白组分。整个提取过程均在低温下进行,防止蛋白质发生变性。

1.3.6 多糖和蛋白含量测定

采用GB/T 9695.31—2008苯酚-硫酸法测定总糖含量;GB 5009.5—2016凯氏定氮法测定蛋白质含量。

1.3.7 多糖及蛋白的傅里叶红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)分析

取经冻干的含锌粗多糖组分及含锌粗蛋白组分样品约1～2 mg,分别与烘干的200 mg KBr在干燥的环境下充分研磨混匀,模具中压片,通过FTIR在4 000～400 cm-1处进行扫描,采用OPUS软件对所得的红外光谱图进行初步分析。蛋白质红外图谱的酰胺Ⅰ带(1 700～1 600 cm-1)运用Peakfit Version 4.12软件进行基线校正,Gaussian去卷积,再用二阶导数图谱进行高斯曲线拟合,通过软件自动多次拟合,使残差达到最小;再根据各子峰与蛋白质二级结构的对应关系,计算各子峰面积占总面积的比率,得出蛋白质二级结构的含量变化。

1.4 数据处理

所有实验均重复3次以上,采用Excel、Origin 2021、GraphPad Prism 8.0软件分析数据及作图,方差分析(One-Way ANOVA,P<0.05)和Duncan的多重检验用于确定样本之间差异显著性。

2 结果与分析

2.1 热加工对牡蛎总锌含量的影响

经热加工后牡蛎中总锌含量的变化如图1所示,未经热加工的生鲜组其锌含量为1 654.80 μg/g(干基,下同),与BILANDZIC等[12]测定的牡蛎锌含量结果一致;蒸制和油炸处理后,锌含量较生鲜牡蛎显著降低(P<0.05),且油炸处理后锌含量显著低于蒸制处理;而烤制后的牡蛎锌含量与其生鲜含量无显著差异(P>0.05)。造成该结果可能是由于热加工过程中产生流失液,锌元素也伴随着损失,其中油炸组加工较为剧烈,牡蛎中化学成分发生较大变化,从而锌含量变化较显著。HOSSEINI等[13]研究发现里海白鱼经微波、煮沸、烘烤和油炸4种加工方式,其锌含量都发生减少,其中煮沸使锌含量显著降低。MNARI等[14]发现鲷鱼经蒸、煮、烤、炸热加工方式均使锌含量减少,其中油炸对矿物质的损失最显著,与本实验结果一致。

图1 热加工对牡蛎总锌及锌离子含量的影响Fig.1 Effects of thermal processing on the content of total zinc and zinc ion in oysters注：不同字母表示同一类别组间具有显著差异(P<0.05)(下同)

2.2 热加工对牡蛎锌离子含量的影响

牡蛎经热加工后其锌离子含量的变化如图1所示,热加工均使锌离子的含量极显著降低(P<0.01),且油炸处理后锌离子含量显著低于蒸煮和烤制处理;锌离子占总锌含量也随热加工发生变化,蒸制、油炸和烤制处理均使牡蛎中锌离子含量占比降低。结果表明,热加工使牡蛎中总锌、锌离子含量及锌离子所占比例均降低,可能是因为热加工使锌离子伴随流失液产生损失,且热加工使蛋白、多糖等有机物发生变性,破坏有机物结构,形成不溶性成分[15],影响锌元素的吸附和化学键结合状态,使锌离子被包裹或结合,导致锌离子的含量降低。

2.3 热加工对牡蛎多糖锌的影响

牡蛎经过热加工后,进行分级提取水溶多糖及碱溶多糖,研究多糖中锌含量变化。结果如表1所示,牡蛎多糖主要为水溶多糖,含量为(130.7±2.75)mg/g;热加工后牡蛎中水溶多糖及碱溶多糖更易于提取,蒸制、油炸和烤制后水溶多糖的含量显著高于生鲜牡蛎(P<0.05),烤制后碱溶多糖的含量显著高于其他热加工方式和生鲜牡蛎(P<0.05);相反的,热加工后水溶多糖的锌含量显著减少,且蒸制组和油炸组较烤制组显著降低,而碱溶多糖锌含量随着多糖含量的升高而升高。(锌/多糖)值可反映多糖与锌的结合率,(锌/多糖)值越高,说明多糖结合的锌含量越高。从图2可知,生鲜组碱溶多糖的锌结合量高于水溶多糖约9倍,说明多糖中碱溶多糖是锌结合的主体,结合率可达(39.92±2.5)μg/mg。热加工后,水溶和碱溶多糖的锌结合量都显著下降(P<0.05),对于水溶多糖,蒸制组锌结合率下降74.51%,油炸组下降71.93%,烤制组下降60.13%;对于碱溶多糖,蒸制组锌结合率下降28.06%,油炸组下降37.95%,烤制组下降55.26%,可推测牡蛎中多糖锌经过热加工后,锌离子发生脱落,且伴随流失液损失。

表1 热加工对牡蛎多糖及锌含量的影响Table 1 Effects of thermal processing on oyster polysaccharide and zinc content

图2 热加工对牡蛎多糖锌含量的影响Fig.2 Effects of thermal processing on the content of polysaccharide zinc in oysters

热加工对多糖锌结构的影响鲜有报道,但有研究发现,高温处理对多糖的分子质量及结构会产生一定的影响;ELIYAS等[16]研究发现不同的提取温度会导致蛹虫草多糖的空间结构发生变化。LI等[17]研究热处理对灰树花水溶多糖的影响,结果表明热处理使多糖发生降解,(1→3,4) α-D-糖苷键含量显著减少,其分支程度降低。由此可推测,热加工对多糖的结构产生影响,进而影响多糖与锌的结合,使其结合率下降。

2.4 热加工对牡蛎蛋白锌的影响

牡蛎经过热加工后,分级提取水溶蛋白及盐溶蛋白,研究蛋白中锌含量的变化。结果如表2所示,经热加工后,水溶蛋白及盐溶蛋白的提取含量较生鲜组显著下降(P<0.05),锌的含量也显著减少(P<0.05),可能是由于蛋白发生热变性,使其溶解度下降[18];图3显示,生鲜状态下牡蛎的水溶蛋白锌结合率为(3.88±0.92)μg/mg,经过热加工后(锌/蛋白)值极显著降低(P<0.01),蒸制组水溶蛋白锌结合率下降73.68%,油炸组下降74.38%,烤制组下降64.25%;而对于盐溶蛋白,锌结合含量几乎不受热加工的影响。

目前对于蛋白锌的研究主要集中在其结构的测定[19],而热加工对蛋白锌的影响尚未有研究报道。蛋白质结构对环境条件敏感,温度的升高,会造成蛋白质的结构和功能发生变化,如局部展开、疏水性增加、等电点变化等;维持蛋白质二级和三级结构的键在热处理过程中被削弱,导致蛋白质疏水部位变性和暴露[20]。LI等[21]采用100 ℃处理牡蛎铁蛋白,研究发现热处理导致铁蛋白二级结构及三级结构遭到破坏,引起铁蛋白的聚集和变性。因此可推测,热加工造成牡蛎中的蛋白质结构发生变化,进而影响蛋白与锌的结合。

表2 热加工对牡蛎蛋白及锌含量的影响Table 2 Effects of thermal processing on oyster protein and zinc content

图3 热加工对牡蛎蛋白锌含量的影响Fig.3 Effects of thermal processing on the zinc content of oyster protein

2.5 热加工对牡蛎含锌多糖及蛋白红外分析

a-水溶多糖;b-碱溶多糖;c-水溶蛋白;d-盐溶蛋白A为生鲜组;B为蒸制组;C为油炸组;D为烤制组图4 热加工处理后牡蛎多糖及蛋白的红外光谱图Fig.4 Infrared spectra of polysaccharides and proteins after thermal processing

蛋白质的FT-IR图谱中,酰胺Ⅰ带的峰型受蛋白质二级结构影响,其中1 646～1 664 cm-1为α-螺旋特征峰,1 615～1 637 cm-1和1 682～1 700 cm-1为β-折叠特征峰,1 664～1 681 cm-1为β-转角特征峰,1 637～1 645 cm-1为无规卷曲特征峰[24]。图5为生鲜状态下牡蛎水溶蛋白及盐溶蛋白酰胺Ⅰ带高斯曲线拟合图,结合图6可发现,牡蛎水溶及盐溶蛋白中不存在无规则卷曲结构。对比生鲜组,经过热加工牡蛎的水溶蛋白中α-螺旋含量伴随着热加工温度的升高而升高;而β-折叠及β-转角含量随着热加工的温度升高而逐渐降低,说明热加工使β-折叠及β-转角结构向α-螺旋结构转变,而β-折叠结构由于氢键的作用存在于蛋白质的内部结构[25],β-折叠结构含量的降低可推测蛋白质的氢键断裂,与图4-c水溶蛋白的红外光谱图3 700～3 200 cm-1吸收峰处的变化相对应;热加工对盐溶蛋白二级结构的变化产生影响,油炸组各结构的含量占比与生鲜组基本相似,蒸煮组与烤制组的各结构含量占比相似,蒸制及烤制处理后盐溶蛋白的α-螺旋结构向β-转角结构转变,有研究报道,长时间热处理会造成7S球蛋白α’亚基和α亚基构成热聚集体,且热聚集体中β-折叠结构易向β-转角结构转变[26]。热加工处理可能使盐溶蛋白产生热聚集体,从而使α-螺旋结构减少,β-转角结构增多。

a-水溶蛋白;b-盐溶蛋白图5 生鲜状态下牡蛎蛋白酰胺Ⅰ带高斯曲线拟合图Fig.5 Gaussian curve fitting of amideⅠof oyster proteins in fresh state

a-水溶蛋白;b-盐溶蛋白图6 不同热加工牡蛎蛋白二级结构的含量Fig.6 Estimated secondary structures of oyster proteins subjected to different heat-processed

以上结果表明,热加工使牡蛎中水溶蛋白及盐溶蛋白结构遭受破坏,且蛋白的锌结合率下降,推测蛋白质的空间结构及化学键的变化影响锌元素的结合状态,造成锌元素的损失,由于结构分析实验所用多糖锌及蛋白锌纯度不高,对于多糖与蛋白的锌结合键的影响,有待进一步的研究。

3 结论

食物中锌元素的存在形态与其营养价值密切相关。本研究探讨蒸制、油炸和烤制3种热加工处理对牡蛎中锌元素存在形态的影响。结果显示：牡蛎经热加工后,总锌含量及锌离子含量具有不同程度地下降。蒸制过程总锌含量损失6.43%,锌离子含量下降45.60%;油炸过程总锌含量损失14.68%,锌离子含量下降68.12%;烤制过程总锌含量未发生明显变化,但锌离子含量下降50.59%。热加工使多糖和蛋白的锌结合能力显著下降,经蒸制、油炸、烤制后水溶多糖的锌结合率分别下降74.51%、71.93%、60.13%;碱溶多糖锌结合率分别下降28.06%、37.95%、55.26%;水溶蛋白的锌结合率分别下降73.68%、74.38%、64.25%;而对于盐溶蛋白,锌结合含量几乎不受热加工的影响。红外光谱图显示,多糖的官能团及化学键没有明显变化,进一步推测牡蛎多糖是通过吸附的方式与锌结合,热加工后,破坏其吸附作用使锌脱落;蛋白的红外光谱分析表明,热加工使蛋白的官能团及二级结构发生变化,推测蛋白的空间结构及化学键的变化影响锌元素的结合状态,造成锌元素的损失。