健康体检人群血清胆红素水平对颈动脉粥样硬化进展影响的队列研究

秦璐 ，谷永胜 ，李琳 ，张凯华 ，姚文涛 ，吴宗锴，何伟亮，牛小莉，李俐涛，王贺波*

脑血管病发病率、致残率、死亡率高，是影响居民生活质量的重要原因。全球疾病负担研究显示，缺血性脑血管病约占所有脑血管病事件的62.4%［1］，脑血管病已成为我国健康寿命损失的第一病因［2］。目前认为，动脉粥样硬化是缺血性心脑血管病发生、发展的重要病理学基础［3］，而超声测定颈动脉内膜-中膜厚度（carotid intima-media thickness，cIMT）作为一种临床常用的无创性动脉粥样硬化检测方法，已在世界范围内被广泛使用［4］。横断面研究表明，血清总胆红素（total bilirubin，TBIL）水平与高血压、高脂血症患者cIMT呈负相关［5-7］，提示TBIL可能为动脉粥样硬化的保护因素，但目前探究TBIL和间接胆红素（indirect bilirubin，IBIL）作用的大型队列研究较少。本研究通过回顾性队列研究方法，应用彩色超声诊断仪测定cIMT，探讨TBIL和IBIL平均暴露水平对健康体检人群颈动脉粥样硬化进展的影响，以期为脑血管病防治提供新思路。

1 对象与方法

1.1 研究对象 本队列研究数据来自2010年1月至2019年12月于河北省人民医院体检中心进行健康体检者。所有研究对象均为石家庄地区居民。纳入标准：（1）初次体检时cIMT≤1 mm；（2）进行≥2次的体检且初次体检时TBIL≤34.2 μmol/L。排除标准：（1）初次体检或随访结束时的TBIL和/或IBIL数据缺失者；（2）潜在的吉尔伯特人群，即TBIL＞34.2 μmol/L，天冬氨酸氨基转移酶（AST）＞80 U/L和/或丙氨酸氨基转移酶（ALT）＞80 U/L者［8］；（3）严重肾脏疾病、心功能不全，以及醛固酮增多症、库欣综合征等糖脂代谢异常者。本研究经河北省人民医院伦理委员会审核批准（编号：2021102）。

1.2 资料收集 （1）一般资料收集。第一次体检时收集参与者信息，包括年龄、性别、吸烟和饮酒状况、既往史。（2）体格检查。测量身高、体质量，计算体质指数（BMI）；使用自动血压计测量静坐血压，包括收缩压和舒张压，测血压前休息5 min，均检测右手臂，间隔5 min后复测，计算两次测量的平均值。（3）实验室检查。第一次体检时禁食至少8 h，采集静脉血液标本，采用血液分析仪测定白细胞计数（WBC）、中性粒细胞计数（NEUT）。采用日本日立公司全自动生化分析仪进行生化指标检测。采用CHOD-PAP底物法测定血清总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG），采用直接法和选择抑制法分别测定高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C），采用国际临床化学与检验医学联合会推荐方法测定AST、ALT，采用己糖激酶法测定血糖，采用脲酶-谷氨酸脱氢法测定尿素氮（BUN），采用碱性苦味酸法测定血肌酐（Scr），采用钒酸盐氧化法测定TBIL和直接胆红素（direct bilirubin，DBIL），计算IBIL。（4）超声检查。应用彩色超声诊断仪（佳能医疗系统和西门子医疗系统）测量cIMT，医师经过标准化专业培训并获得资格认证。纵向扫描双侧颈动脉（图1），动脉壁的两条高回声线分别为内膜线和中膜线，两条高回声线之间的距离即为cIMT，测量双侧cIMT取平均值。

图1 颈动脉内膜-中膜厚度的测量Figure 1 Measurement of carotid intima-media thickness

1.3 定义与诊断标准 （1）高血压：收缩压/舒张压≥140/90 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa），或既往诊断为高血压，目前正在服用降压药物者［9］。（2）糖尿病：空腹血糖≥7.0 mmol/L或餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L或口服葡萄糖耐量试验（OGTT ）2 h血糖≥11.1 mmol/L，或既往诊断为糖尿病，目前应用降糖药物或胰岛素者［10］。（3）BMI分组：以BMI=24 kg/m2作为成年人超重与否的分界线［11］。（4）IBIL计算公式：IBIL=TBIL-DBIL。（5）估算的肾小球滤过率（eGFR）计算公式：eGFR=175×Scr-1.154×年龄-0.203×（0.742女性）［12］。（6）肾功能不全是指有慢性肾脏病史且eGFR＜60 ml·min-1·（1.73 m2）-1的患者。（7）心功能不全：纽约心功能分级为Ⅳ级，即休息时也有心源性呼吸困难症状者。（8）吸烟定义为目前吸烟或既往吸烟而戒烟未满3年，饮酒定义为每日饮用白酒＞40 g。（9）随访终点：颈动脉粥样硬化进展，即体检发现cIMT＞1 mm；如随访期内cIMT未增加，则以最后一次体检时间为随访终点。（10）分组定义：颈动脉粥样硬化进展组为随访终点时cIMT＞1 mm；非进展组为直至随访结束，cIMT≤1 mm。

1.4 统计学方法 采用Excel软件导出数据并双人整理核查，采用R 4.0.3软件进行统计分析。正态分布的计量资料采用（±s）表示，两组比较采用独立样本t检验；非正态分布的计量资料采用中位数（四分位数间距）〔M（QR）〕表示，两组间比较采用Mann-WhitneyU检验；计数资料采用相对数表示，两组间比较采用χ2检验。以胆红素水平为自变量构建Cox比例风险回归模型，采用方差膨胀因子诊断法检验混杂因素之间是否存在共线性，排除方差膨胀因子＞5的混杂因素，分析血清胆红素水平与颈动脉粥样硬化进展的关系。由于部分参与者的血清清蛋白信息不完整，本研究在主模型分析中没有考虑血清清蛋白水平，通过调整有清蛋白数据的参与者的血清清蛋白水平进行敏感性分析，验证结论。以P＜0.05（双侧）为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象颈动脉粥样硬化进展情况 共入选11 394例研究对象，其中女3 962例（34.77%），男7 432例（65.23%），平均基线年龄（48.6±12.4）岁，参与者的平均随访时间为（2.39±1.46）年；在随访期间，1 586例（13.92%）cIMT增加，纳入颈动脉粥样硬化进展组，9 808例（86.08%）cIMT无增加，纳入非进展组。

2.2 颈动脉粥样硬化进展组与非进展组基线特征比较 颈动脉粥样硬化进展组与非进展组年龄、性别、BMI、高血压史、糖尿病史、LDL-C、TC、TG、ALT、AST、BUN、eGFR水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；吸烟史、饮酒史、WBC、NEUT、HDL-C、Scr水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 颈动脉粥样硬化进展组与非进展组基线特征比较Table 1 Comparison of characteristics between the carotid atherosclerosis progressive group and non-progressive group

2.3 颈动脉粥样硬化进展组与非进展组不同性别研究对象TBIL和IBIL水平比较 颈动脉粥样硬化进展组平均TBIL和IBIL水平分别为（14.59±4.60）μmol/L和（10.90±3.54）μmol/L，非进展组平均TBIL和IBIL水平分别为（14.44±4.60）μmol/L和（10.89±3.63）μmol/L，两组间TBIL及IBIL水平比较，差异无统计学意义（tTBIL=1.26，PTBIL=0.211；tIBIL=0.08，PIBIL=0.937）。在颈动脉粥样硬化进展组和非进展组中，男性的TBIL和IBIL水平均高于女性，差异有统计学意义（P＜0.001），见表2。

表2 颈动脉粥样硬化进展组与非进展组不同性别研究对象TBIL和IBIL水平比较（±s，μmol/L）Table 2 Comparison of TBIL and IBIL levels between different genders in carotid atherosclerosis progressive group and non-progressive group

表2 颈动脉粥样硬化进展组与非进展组不同性别研究对象TBIL和IBIL水平比较（±s，μmol/L）Table 2 Comparison of TBIL and IBIL levels between different genders in carotid atherosclerosis progressive group and non-progressive group

注：TBIL=总胆红素，IBIL=间接胆红素

性别 例数 TBIL IBIL颈动脉粥样硬化进展组男1 109 15.34±4.69 11.38±3.64女477 12.16±3.86 9.79±3.01 t值 -11.04 -9.00 P 值 ＜0.001 ＜0.001非进展组男6 323 15.38±4.63 11.55±3.69女3 485 11.90±4.01 9.69±3.19 t值 -29.64 -26.15 P 值 ＜0.001 ＜0.001

2.4 健康体检人群血清胆红素水平对颈动脉粥样硬化进展影响的Cox回归分析 模型1以cIMT是否增加为因变量（赋值：否=0，是=1），以胆红素水平（赋值：以实际值纳入）为自变量进行Cox回归分析；模型2在模型1基础上校正了性别（赋值：女=0、男=1）和年龄（赋值：＜60岁=0、≥60岁=1）；模型3在模型2基础上校正了BMI（赋值：＜24 kg/m2=0、≥24 kg/m2=1）、吸烟史（赋值：无=0，有=1）、饮酒史（赋值：无=0，有=1）；模型4在模型3基础上校正了高血压（赋值：无=0，有=1）、糖尿病（赋值：无=0，有=1）、HDL-C、LDL-C、TG、TC、ALT、AST、eGFR（计量资料以实际值纳入）。研究队列中5人缺失是否患高血压的信息，85人缺失是否患糖尿病的信息，在进行Cox回归分析时，模型4及敏感性分析中没有纳入缺失信息者。模型4结果显示：TBIL水平每升高1个标准差，颈动脉粥样硬化进展的风险下降6.6%〔HR（95%CI）=0.934（0.881，0.990）〕；IBIL水平每升高1个标准差，颈动脉粥样硬化进展的风险下降17.4%〔HR（95%CI）=0.826（0.777，0.877）〕，见表 3。

表3 健康体检人群血清胆红素水平对颈动脉粥样硬化进展影响的Cox回归分析Table 3 Cox regression analysis of the influence of serum bilirubin level on the progression of carotid artery plaque in healthy subjects

表4显示了在模型4基础上对年龄、性别、BMI、饮酒、吸烟、高血压、糖尿病进一步分层分析（变量赋值同表3）。结果显示TBIL、IBIL对于不同亚组人群颈动脉粥样硬化的保护作用没有统计学差异（P＞0.05）。

表4 在不同分层人群中胆红素对颈动脉粥样硬化进展影响的Cox回归分析Table 4 Cox regression analysis of the effect of bilirubin on carotid plaque progression in different stratified populations

2.5 敏感性分析 为了排除血清清蛋白水平对胆红素与颈动脉粥样硬化进展的混杂影响，且由于仅有部分体检人群有血清清蛋白数据，因此模型5在模型4的基础上进一步校正血清清蛋白水平，结果显示在除外血清清蛋白的影响后，胆红素水平仍是颈动脉粥样硬化进展的保护因素〔HR（95%CI）分别为0.912（0.833，0.998）、0.841（0.767，0.922），P＜0.05〕，见表 3。

3 讨论

本研究采用队列设计，在石家庄地区研究血清胆红素对颈动脉粥样硬化的影响。调整了混杂因素后发现，TBIL和IBIL水平是颈动脉粥样硬化进展的保护因素，IBIL的保护作用更强。

研究表明，胆红素是动脉粥样硬化的保护因素［13］。TAO等［14］进一步研究了IBIL的作用，认为IBIL是动脉粥样硬化的保护因素。本研究结果支持了上述结论，且IBIL的保护作用较TBIL更强。BERGMANN等［15］发现，IBIL对男性和女性的保护作用没有统计学差异，本研究结果支持此结论。一项涉及2 207例研究对象的横断面研究使用肱-踝脉波速度作为观察指标，得出胆红素只对男性有保护作用，对女性没有保护作用的结论［16］。这些研究结果的不同可能与研究设计、人群异质性、胆红素水平不同有关。有研究发现胆红素是最有效的内源性抗氧化剂，在脑梗死等急性氧化应激事件时可迅速增加，其水平与脑梗死的严重程度及不良功能预后呈正相关［17］。但在健康人群和高血压、糖尿病、肥胖等人群中，胆红素具有抗氧化作用，其水平可能与机体氧化应激水平呈负相关，可降低脑血管病的发病风险［18］。胆红素代谢途径如下：血红蛋白分解为脂溶性的IBIL，后者与清蛋白结合，在血液中运输；少于0.01%的胆红素以游离胆红素形式存在；IBIL在肝细胞内尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1的催化下转化为水溶性胆红素［19］，即DBIL，大部分DBIL通过胆道系统排出，小部分DBIL水解为非结合胆红素，即IBIL，进入肠肝循环。胆红素-清蛋白复合物不能自由通过各种生物膜，降低了其对细胞的影响。胆红素在肝脏中的结合反应使得胆红素水溶性增加，利于代谢排出。游离胆红素水平影响其向组织细胞内的转运，因此胆红素对于人体有益还是有害主要取决于游离胆红素水平［20］。游离胆红素水平不稳定且难以测定，故采用IBIL水平代替。因此本研究重点探讨了IBIL对动脉粥样硬化的作用。血液中游离胆红素水平受多种因素影响，血清清蛋白水平是游离胆红素水平的影响因素之一［21］，其可影响胆红素的清除和对机体的作用。在本研究中，调整人群血清清蛋白水平后，TBIL和IBIL对于颈动脉粥样硬化仍具有保护作用。

动脉粥样硬化的典型特征是动脉壁的慢性炎性状态，脂质和炎性细胞的逐渐积累导致内皮功能障碍、动脉壁发生动脉粥样硬化［22］。而胆红素可通过抗氧化、抗感染、免疫调节和阻断细胞间黏附作用，以延缓动脉粥样硬化的发生和进展［20，23-24］。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶家族是体内最重要的活性氧来源，可能参与氧化应激介导的端粒缩短［25］，这一途径可能与动脉粥样硬化的发生及进展密切相关。而胆红素是一种强大的线粒体超氧化物抑制剂，通过胆红素加氧酶抑制NADPH氧化酶活性［26］，从而减少体内超氧化物的产生。胆红素还能清除过多的活性氧，减少自由基诱导的脂蛋白氧化修饰［27］。胆红素通过抑制补体诱导［28］及阻断促炎细胞因子［24］的产生来影响机体的炎性反应途径。在动脉粥样硬化形成过程中，内皮环境的改变导致黏附分子表达增加，触发免疫细胞迁移到动脉壁［29］。研究表明，IBIL可防止肿瘤坏死因子α诱导的细胞间黏附分子蛋白的过度表达，从而抑制免疫细胞向动脉内膜迁移，限制炎性反应，延缓动脉粥样硬化的发生和进展［23］。这为高胆红素血症个体预防动脉粥样硬化提供了理论依据。

本研究的局限性：队列数据中缺乏膳食、运动、调脂药物使用、糖尿病患者血糖控制情况、是否使用胰岛素等信息，所以未能校正上述混杂因素，可能使胆红素对动脉粥样硬化进展影响的估计受影响；同时，本研究人群仅源于石家庄地区，且为回顾性队列研究，亟待今后开展多中心、前瞻性队列研究。

综上所述，胆红素是动脉粥样硬化进展的影响因素，TBIL和IBIL水平每升高1个标准差，颈动脉粥样硬化进展的风险分别下降6.6%和17.4%。胆红素在不同性别、年龄、BMI、高血压、糖尿病、吸烟、饮酒特征人群中对颈动脉粥样硬化的影响无差异。本研究对临床医师早期预防和治疗动脉粥样硬化性疾病有一定的借鉴意义。

作者贡献：秦璐负责文章的构思与设计、论文撰写；秦璐、谷永胜、王贺波负责研究的实施与可行性分析、结果的分析与解释；秦璐、谷永胜、李琳、张凯华负责数据收集；秦璐、谷永胜、李琳、张凯华、姚文涛负责数据整理；秦璐、谷永胜负责统计学处理；秦璐、吴宗锴、何伟亮、王贺波负责论文的修订；秦璐、牛小莉、李俐涛负责英文的修订；王贺波负责文章的质量控制及审校，并对文章整体负责，监督管理。

本文无利益冲突。