山西不同产地野生葛根外植体灭菌条件优化分析

张 静，王刚狮，刘瑞霞，时宝凌，廉梅霞

（山西林业职业技术学院，山西 太原 030009）

1 材料与方法

1.1 材料

选择3种质地具有明显差异、代表不同生长阶段的山西野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi根作为材料，具体情况见表1。愈伤组织诱导培养基为MS基本培养基。

表1 3种野葛根外植体来源及质地Tab.1 Source and textureof threewild Radix Puerariae explants

1.2 方法

将采集回的新鲜野葛根材料去掉叶片，用毛刷轻轻将根表面的泥土去掉，选择根表皮完整、无破损的葛根作为试验材料。将其切成10 cm左右的根段，挑选粗细均匀、并各自分成6组（共18组）放入锥形瓶内，分别置于超净工作台，锥形瓶内分别加入质量分数75%乙醇，晃动30 s，再分别移入质量分数0.1%、0.2%的HgCl2溶液中消毒8 min、10 min和12 min（见表2）。随后，无菌水冲洗5次，用镊子和手术刀去掉根两端变黑的部分，将消毒后的外植体切成0.5 cm长的小段，接种于MS培养基上。每瓶接种4块消毒后的外植体，每个处理接种6瓶。置于25℃的人工气候箱中，黑暗培养，每3 d观察记录1次外植体污染与愈伤组织诱导情况。

表2 葛外植体消毒灭菌处理Tab.Disinfection and sterilization of Radix Puerariae explants

2 结果

观察发现，在接种后4 d，有些外植体的表面便开始出现白色的霉菌菌丝，表明消毒不彻底。培养9 d，所有消毒未达标的外植体表面均长出白色菌丝体。外植体污染与愈伤组织诱导情况见图1~图3。

图1 大同市灵丘县产野葛外植体消毒灭菌试验结果Fig.1 Results of wild Radix Puerariae explants in Lingqiu County

图3 晋城市泽州县产野葛外植体消毒试验结果Fig.3 Resultsof wild Radix Puerariae explantsin Zezhou County

死亡率=未出现愈伤组织块数/未污染的接种块数

由图1可知，脆、嫩、表皮浅褐色的大同灵丘野葛在质量分数0.1%的HgCl2溶液中消毒8 min、10 min、12 min，虽然根细胞死亡率为0，但无法达到理想灭菌效果，污染率高达83.3%~67.5%；在质量分数0.2%的HgCl2中，灭菌时间10 min，污染率虽减少为4.1%，但在杀死细菌等微生物的同时，植物根细胞也被杀死，死亡率为17.5%；当质量分数0.2%HgCl2消毒12 min时，污染率虽然0，但33.3%的外植体均被杀死。因此，脆、嫩、表皮浅褐色的大同灵丘野葛根的最佳消毒条件为：质量分数75%乙醇处理时间30 s，质量分数0.2%的HgCl2溶液浸泡8 min，此时，污染率为8.3%，死亡率为5%。

由图2可知，坚实、较嫩、表皮浅褐色的运城平陆产野葛的最佳灭菌条件为：质量分数75%酒精处理时间30 s，质量分数0.2%的HgCl2溶液浸泡8 min。在此条件下外植体的污染率为10.2%，外植体死亡率为0。

图2 运城市平陆县产野葛外植体消毒试验结果Fig.2 Resultsof wild Radix Puerariae explantsin Pinglu County

由图3可知，坚实、较硬、表皮粗糙、深褐色的晋城泽州产野葛的最佳灭菌条件为：质量分数75%乙醇处理时间30 s，质量分数0.2%HgCl2溶液消毒10 min。在此条件下外植体的污染率为5.7%，死亡率为32.2%。

3 讨论

组织培养的第一步是获得无菌的外植体，而不同情况的外植体应该选择其适宜的灭菌试剂与方法，特别是珍贵、不易获得的材料。若外植体消毒方法不当，可能导致试验材料损失，无法进行后续试验。因此，选用合适的消毒剂种类、浓度与灭菌时间是解决污染的关键[1]。常用的消毒试剂有质量分数75%乙醇、HgCl2。质量分数75%乙醇具有较强的穿透力与杀伤力，是最常用的表面消毒剂，但其对组织、细胞的伤害程度也高，通常与其他消毒剂配合使用[1]。HgCl2是目前杀菌效果最好的消毒剂，其杀菌原理是Hg+与带负电荷的蛋白质结合，导致蛋白质变性[2]，从而杀死细菌等微生物，但HgCl2更易外植体表面残留，汞又较难去除，因此，使用后需用无菌水冲洗多次，降低汞的残留。本试验采用质量分数75%乙醇配合不同浓度的HgCl2对不同来源的野葛外植体进行消毒，均达到了理想的效果。其中大同灵丘产野葛，只需质量分数75%乙醇处理时间30 s、质量分数0.2%的HgCl2溶液消毒8 min即可达到理想效果；晋城泽州产野葛质地较硬、根段中间深褐色、枯朽，代谢缓慢使用质量分数0.2%的HgCl2溶液消毒10 min，虽然可以杀灭绝大多数的体表微生物，污染率为5.7%，但外植体的1/3死亡。

在制定消毒方案时，还需要考虑到外植体的采集季节、所处的生理状态等[3]。对于在野外、大田采集到的外植体，表面带有大量的泥土，特别是根作为外植体污染率会更高，但考虑到野葛根中含有较高的次级代谢产物，有利于后期葛根素、异黄酮等有效成分的获得，因此应当选择生长旺盛期、代谢快、颜色浅、质地脆嫩的葛根作为外植体。在外植体采集时，还应当避免阴雨天等潮湿天气，潮湿的空气更加适合杂菌的生长，从而增加外植体的污染率。在本试验中，大同市灵丘产的野葛根脆、嫩、表皮浅褐色，内源激素充足、具有更强的抗菌能力；而晋城泽州产野葛处于生长衰退阶段，深褐色、枯朽，不仅污染率高，外植体活性较弱、抗逆性差，不是理想的外植体材料。