1-MCP处理对早酥梨衰老的影响

张海霞

（武威职业学院，甘肃 武威 733000）

早酥梨作为西北地区主栽产品之一，成熟于8月中旬，果形美观，果皮翠绿、光滑，肉质细嫩，风味好，水分多，品质上乘[1-2]，深受消费者欢迎。其主要销售市场在广州、福建等南方地区，在市场上具有很强的竞争力。但上市时正值酷暑高温，果实呼吸作用强，容易造成果皮发黄、肉质变软，失去了原有的商品性状，使货架期大大缩短，令种植户和销售商遭受巨大的经济损失[3]。因此，解决早酥梨的生理衰老问题对于推进优质梨基地的产业化、提高经济效益有重要意义。

乙烯是成熟衰老激素[4]，在果蔬贮藏过程中，乙烯能促进果蔬的成熟衰老。近几年来，人们在寻求更有效的抗乙烯生理作用的化学物质的方面，发现有一些环丙烯化合物能够和乙烯受体发生不可逆结合，进而对乙烯效应产生强烈的抑制作用，如CP（亚甲基环丙烯）、3，3-DMCP（3，3-二甲基环丙烯）、1-MCP（1-甲基环丙烯）和3-MCP（3-甲基环丙烯），其中1-MCP的效果最佳，它具有无毒、稳定、使用浓度低等特点。

1-MCP属于乙烯竞争性抑制剂，不仅可以阻止受体与乙烯的正常结合，还能与乙烯受体进行不可逆结合，从而阻碍乙烯信号传导，起到延缓成熟的作用，能够明显延长呼吸跃变型果实的贮藏期和货架期。国内外对它的研究多地集中在花卉和果品上，并取得了一些较理想的结果。汪俏梅、郭得平等在青花菜的研究中发现，经1-MCP处理的青花菜其贮藏期间的MDA含量呈现出下降趋势，而CAT和SOD两者的活性在不断增大，说明1-MCP处理可以对抗氧化酶系统进行调节而使青花菜的衰老得以延缓[5]。白华飞，杨晓棠等用1-MCP处理青枣，发现1-MCP能够有效减缓果实膜透性的增大，丙二醛含量远低于对照，并提高了青枣SOD、POD的活性[6]。李敏等用0.25μl/L 1-MCP处理台农果实，不仅能够使果实失重率降低，可滴定酸含量的下降推迟，还能够抑制PG（多聚半乳糖醛酸酶）活性的增加，从而延缓果实的后熟作用[7]。高敏和张继澍的研究发现，1-MCP处理能够明显抑制SOD（超氧化物歧化酶）和POD（过氧化物酶）活性在前期的上升和后期的下降[8]。

目前，关于1-MCP在水果贮藏保鲜上应用的研究报道不少，但尚未见到将1-MCP应用于早酥梨抗氧化酶的研究。本研究以早酥梨为材料，用不同浓度的1-MCP处理果实，研究常温贮藏期间果实黄化、丙二醛含量、细胞膜透性及三种抗氧化酶（SOD、CAT、POD）的变化，为早酥梨采后衰老的控制提供理论依据。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

早酥梨采收自甘肃景泰县条山农场一个管理良好的盛果期果园，8月中旬采摘，选择无机械损伤、无病虫害、大小均匀的果实进行套袋装箱，并于当天运回实验室进行处理。试验试剂：1-MCP（1-甲基环丙烯，商品名：安喜培），片剂（由台湾利统公司生产）。

1.2 材料处理方法

准确称取0.5 g、1.0 g、1.5 g的1-MCP分别置于3个小烧杯中，分别与待处理的果品同置于1 m3的塑料帐中，向烧杯中分别加入15 mL、30 mL和45 mL的蒸馏水并立即密封帐子，使帐内气体浓度分别达到0.5μl/L、1.0μl/L、1.5μl/L，常温密闭熏蒸12 h，待熏蒸结束，即刻将果实装进纸箱于常温下贮藏。对照组果实以空气中密闭12 h后装入纸箱同样于常温下贮藏。每处理用果40个，重复试验3次，定期（0 d、4 d、8 d、12 d、16 d、20 d）取样测定。

1.3 试验测定方法

1.3.1 果皮黄化指数的评估

将黄化指数分为4级，即果皮全绿（1级）、果皮绿微黄（2级）、果皮浅黄（3级）、果皮全黄（4级），如果黄化指数大于等于3级，则认为其已经到达了货架末期。在常温放置期间，通过视觉感官评定方法对早酥梨的黄化指数进行评估。

1.3.2 组织膜透性的测定

参照张昭其等[9]方法并修改。在5个果实相同部位切取1 mm厚的薄片组织15片，用无离子水冲洗3次后用滤纸吸干组织表面水分，再放入烧杯中加入40 mL无离子水，采用电导仪测定初始及3 h后的电导率，测定温度为25℃，然后将烧杯放入95℃的水浴箱中进行水浴，水浴30 min测定最终电导率，计算细胞膜完整率，见公式（1）。

1.3.3 MDA（丙二醛含量）测定

参照Hodgesetal[10]方法。用紫外分光光度计（导津UV-2450）测出反应液在450 nm、532 nm和600 nm三处的吸光度值，再运用公式计算反应液中MDA的浓度（CMDA）和果实样品中MDA的含量（nmol•g FW-1）。计算公示如下：

1.3.4 POD（过氧化物酶）活性测定

参考李合生[11]方法。将3 g果肉组织放入研钵中，加3 mL磷酸缓冲液（0.05 mol/L、pH5.9的磷酸缓冲液，每100 mL中加入PVP0.5 g）和石英砂少许，在冰浴条件下快速研磨至匀浆，再在4℃的条件下以8 000 r/min离心20 min，获得上清液，即酶粗提液。测定POD活性时，分别取1.8 mL愈创木酚（0.05 mol/L）、30μl经稀释的酶液（50μl酶液加150μl磷酸缓冲液）和100μl H2O22%进行混合，混匀后于470 nm波长下比色，每隔1 min记录1次吸光度，共记录3次。以每分钟内A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位（u）。见公式（4）。

式中：△A470——反应时间内吸光度的变化；W——果实鲜质量，g；t——反应时间，min；Vt——提取酶液总体积，mL；Vs——测定时取用酶液体积，mL。

1.3.5 SOD（超氧化物歧化酶）活性测定

粗酶液提取参照Lacan and Baccou[12]方法。

从6个果实中获取果肉样品3.0 g，加入3 mL提前预冷的pH 7.5的磷酸缓冲液（含5 mmol/L二硫苏糖醇和2%PVP）100 mmol/L，在冰浴条件下快速研磨至匀浆后，在4℃的条件下以12 000×g离心30 min，收集上清液用于CAT和SOD两项指标的测定。

SOD活性测定：使用10 mL指形玻璃管，依次加入磷酸缓冲液（1.5 mL，50 mmol/L）、甲硫氨酸（MET）溶液（0.3 mL，130 mmol/L）、氮蓝四唑（NBT）溶液（0.3 mL，750μmol/L）、EDTANa2溶液（0.3 mL，100μmol/L）和酶提取液（0.3 mL），最后加入核黄素（0.3 mL，20μmol/L）。对照2支玻璃管中的酶液用缓冲液代替，混匀后将其中1支玻璃管放在暗处，其他各玻璃管均放在4 000 lx日光灯下反应15 min。反应完成后，以暗处放置的玻璃管液体做空白参照，分别测定其他各玻璃管混合液在560 nm处的吸光度值。SOD活性以每毫克蛋白抑制氮蓝四唑（NBT）光化还原的50%为一个酶活性单位（U）表示。

1.3.6 CAT（过氧化氢酶）活性测定

参考Larrigaudièreetal等[13]人方法，将3 mL 10 mmol/L H2O2（以50 mmol/L pH7.5的磷酸缓冲液配制）和100μl粗酶液混合构成酶促反应体系，记录2 min内自酶液加入后每隔30 s反应体系于240 nm处的吸光度值。酶活性用△OD240•min-1•mg-1蛋白质表示。

1.3.7 蛋白含量的测定

根据Bradford[14]考马斯亮蓝法，以G-250型考马斯亮蓝溶液和牛血清蛋白混合液的吸光度制作标准曲线，回归方程y=0.834 7x-0.047 5，x=吸光度（0.556-1.032），y=蛋白值。样品测定时，在50μl粗酶液中加入2 mL G-250型考马斯亮蓝溶液，充分混合2 min后倒入比色皿中，1 min后于595 nm波长下吸光度值，根据吸光度查标准曲线。

1.4 数据统计分析

全部试验数据用Microsoft Excel计算平均值和标准误差并制图。

2 结果与分析

2.1 1-MCP处理对果皮黄化指数的影响

由图1可以看出，在常温贮藏期间，随着贮藏期的延长，早酥梨果皮的黄化指数逐渐升高；对照组在第12 d就到了货架末期（果皮浅黄），第20 d时果皮全黄，黄化指数达到4级；1-MCP 0.5μl/L处理在第16 d时果皮绿微黄（2级），第20 d时果皮绿微黄（2级）；经1-MCP1.0与1-MCP1.5μl/L处理的果实在整个贮藏期间黄化指数始终保持在1级，说明1-MCP处理能够明显延缓早酥梨果皮的黄化，延长早酥梨的贮藏期，其中以1-MCP1.0与1-MCP1.5μl/L效果最好。

图1 1-MCP处理对果皮黄化指数的影响Fig.1 Effect on pericarp yellowing index

2.2 1-MCP处理对细胞膜透性的影响

由图2可知，贮藏期间组织细胞膜透性逐渐增加，贮藏前期对照和处理之间差异不明显，贮藏8 d后，对照果皮膜透性迅速增加，而经过1-MCP处理的其增长均比较缓慢，20 d后，差异效果最为显著。对照组膜透性为63%，经0.5μl/L、1.0μl/L和1.5μl/L处理的果实其膜透性分别为52%、38%、40%，分别比对照减少了11%、25%、23%，可见1-MCP显著减缓了细胞膜透性的增加，表明1-MCP处理能在一定程度上维持细胞膜的完整性。其中以浓度为1.0μl/L、1.5μl/L的效果最好。

图2 1-MCP处理对细胞膜透性影响Fig.2 Effect on cell membrane permeability

2.3 1-MCP处理对丙二醛（MDA）含量的影响

膜结构的破坏是膜脂过氧化作用的结果，MDA是膜脂过氧化降解的典型产物，通常把MDA含量作为植物衰老的指标之一。除对照和0.5μl/L 1-MCP处理的果实外，其他两组处理的MDA含量在贮藏期间是不断增加的（见图3）。处理组MDA含量始终低于对照，而且随着贮藏天数的增加，处理与对照之间的差异越来越明显，在16 d时，经0.5μl/L、1.0μl/L和1.5μl/L 1-MCP处理的果实其MDA含量分别是对照组的85%、72%、67%，说明1-MCP减缓了膜质过氧化程度，减少了MDA的积累，延缓了早酥梨的衰老。

图3 1-MCP处理对丙二醛（MDA）含量的影响Fig.3 Effect on malondialdehyde content

2.4 1-MCP处理对过氧化物酶（POD）活性的影响

在贮藏前期对照与处理的POD活性变化不大，随着贮藏天数的增加，差异效果越来越明显，并且POD活性呈现先增加后降低的趋势，并且都在贮藏至12 d时POD活性达到最高值，不同浓度1-MCP的处理并没有影响到POD活性峰值的出现时间，但都不同程度的增加了POD的活性。其中以浓度为1.0μl/L、1.5μl/L处理的效果最显著（见图4）。

图4 1-MCP处理对过氧化物酶（POD）活性的影响Fig.4 Effect on peroxidase activity

2.5 1-MCP处理对超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响

SOD能够清除植物组织内的超氧自由基，延缓组织的衰老。各处理SOD的活性都呈现逐渐降低的趋势（见图5）。

图5 1-MCP处理对超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响Fig.5 Effect on superoxide dismutaseactivity

1-MCP较对照下降缓慢，酶活性大大高于对照，贮藏前期，对照与处理的差异不显著，随着贮藏天数的增加，对照与处理差异越来越明显。贮藏至20 d时，经浓度0.5μl/L、1.0μl/L、1.5μl/L处理的果实其SOD活性分别为对照的1.67、2.03、2.23倍。说明1-MCP能使果实保持较高的SOD活性，起到延缓衰老的作用，以1.0μl/L、1.5μl/L的处理效果最显著。

2.6 1-MCP处理对过氧化氢酶（CAT）活性的影响

随着贮藏时间的延长，各处理组的CAT水平均表现出先上升后下降的趋势。对照组在贮藏至第8 d时达到最大值，而经1-MCP处理的果实其CAT活性在10 d达到最高，同时，贮藏后期经1-MCP处理的果实CAT活性的下降较对照组也明显缓慢，表明1-MCP可以延缓早酥梨果实常温贮藏前期CAT活性的增加及贮藏后期CAT活性的降低（见图6）。

图6 1-MCP处理对过氧化氢酶（CAT）活性的影响Fig.6 Effect on catalase activity

3 讨论与总结

绿色果蔬的黄化和果实的颜色变化是成熟与衰老的显著标志之一，在这个过程中，伴随的是叶绿素的迅速降解。研究证实，细胞组织损伤、衰老或死亡与机体中膜脂过氧化作用的加强，MDA、活性氧及自由基含量的不断增加有着密切的关系。作为细胞中的保护性酶类，CAT、SOD、POD等能够有效地清除活性氧自由基使细胞内活性氧的平衡得以调解进而延缓组织衰老。鉴于此，采取有效措施对保护性酶类的活性进行调节以实现延缓衰老可以作为今后研究的重点和努力的方向。

本试验表明，采用1-MCP处理早酥梨，可以延缓早酥梨果皮的黄化速度，降低细胞膜透性的增加和MDA的积累，抑制SOD、POD及CAT的活性的下降，从而延缓果实衰老。这与张昭其在台湾青枣的研究上具有相似性[9]。