磁共振扩散张量成像定量评价消炎液微创治疗非压迫性腰椎神经根炎*

2022-04-16杨朝炳吕赛群彭涛牛翔科植彪肖建明

西部医学 2022年4期

杨朝炳吕赛群彭涛牛翔科植彪肖建明

(成都大学附属医院放射科，四川成都 610081)

近年关于腰椎神经根性疼痛研究[1-3]表明，疼痛原因除了椎间盘突出的机械压迫外，还包括非机械压迫因素。随着腰椎神经根非机械压迫机制研究的深入，各种非压迫性腰神经根性疼痛的介入微创治疗得到了飞速发展，患者获益良多，但患者预后定量评估方法有限。磁共振扩散张量成像(Diffusion Tensor Imaging，DTI)能显示神经根走行及量化分析，并能定量评估水分子在组织中的扩散运动[4-6]。腰椎神经根的水分子横向扩散受纤维束多层膜结构的限制，纵向扩散却不受影响，而DTI中的FA值能定量测定水分子在神经纤维束的各向异性值，由此可评价纤维束膜结构的完整性。因此，DTI在外周神经系统的应用越来越广泛并取得了良好的效果[7]。本研究探索磁共振扩散张量成像技术能否定量评估实验猪腰椎非压迫性神经根炎消炎液微创治疗的疗效，为进一步的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物选取健康普通级雌性巴马小型猪共6只，体质量20 kg左右，无跛行，实验前经CT及MRI检查，排除胸腰段脊柱相关疾病。由成都达硕实验动物有限公司提供(生产许可证号：SCXK(川)2013-24)，同时实验进程中的动物饲养工作亦由该公司承担(四川省实验动物使用许可证号：SYXK(川)2014-189)。本研究经医院伦理委员会审核通过。

1.2 MRI检查及图像处理与测量

1.2.1 检查前准备检查前实验动物禁食8 h，禁饮4 h。常规消毒后，肌内注射氯胺酮约300 mg，待进入麻醉状态后，于耳后静脉穿刺静脉留置针，并持续静脉滴注氯胺酮混合液(氯胺酮600 mg+地西泮20 mg+500 mL生理盐水)维持麻醉。实验过程中，密切关注实验动物的一般情况，评估麻醉深度：如因麻醉过浅而不自主运动，可肌内加注氯胺酮100 mg；如因麻醉过深而呼吸抑制，可减缓滴注速率。

1.2.2 检查序列及参数使用SIEMENS AVANTO 1.5T超导型磁共振扫描仪进行检查，使用8通道相控阵脊柱线圈，采取仰卧位、头先进方式固定实验动物，动物中线置于线圈中心，身体长轴平行于主磁场长轴。扫描前进行匀场，然后进行T2WI序列、DTI扫描。T2WI序列：采用可变翻转角的自旋回波序列(spcR)矢状位扫描，TR/TE：2000/117 ms，视野(FOV)250×250 mm，层厚1 mm，层间距0，层数88，平均次数2次，分辨率256×254，相位编码方向：H-F，并行因子2，翻转角150°，带宽399。DTI：采用单次激发自旋回波平面成像序列(SE-EPI)横断位扫描，TR/TE：12000/117 ms，视野(FOV)200×200 mm，层厚3 mm，层间距0，层数48，平均次数5次，分辨率132×132，相位编码方向：A-P，并行因子2，带宽996，弥散方向12，b值0、800。

1.2.3 MRI图像处理与测量图像的后处理工作在SIEMENS工作站进行，运用neuro 3D(MR)软件进行后处理，先将T2解剖图像进行多平面重建，然后将重建后的多平面图像与DTI进行融合，定义参数：b0阈值为60～1353，Diffusion Map阈值0～1000，b值为800。结合横断位T2解剖图像辅助定位进行神经根FA值的测量。测量每根神经根的三个节段，并取其平均值的方法，尽量减小测量误差。感兴趣区(Region of interest，ROI)的大小为12～28 mm2(18.3±7.6 mm2)。ROI放置位置分别为L2～3、L3～4、L4～5双侧神经根椎间孔外段、椎间孔内段及椎管内段的中央区域，测量范围应避免超出所测量的神经根截面，并尽可能多的包含神经根。

1.3 非压迫性神经根炎造模及微创介入治疗

1.3.1 非压迫性神经根炎造模磁共振检查完成后，继续保持实验动物麻醉状态，将实验动物移至CT检查床俯卧位固定，对术区进行常规备皮、消毒、铺巾，在CT引导下用17 cm 19G巴德针穿刺L2～3、L3～4、L4～5椎间盘髓核，连接电动经皮椎间盘旋切器(Stryker instruments，USA)进行椎间盘髓核的旋切，旋切器推进速率为0.5～1 mm/s，每个椎间盘旋切出约1.0 g椎间盘髓核组织，将椎间盘髓核组织置于无菌器皿加入生理盐水，制备成混悬液约12 mL备用。通过CT引导穿刺，分别注入2 mL上述混悬液于L2～3、L3～4、L4～5双侧椎间孔硬膜外腔神经根周围，并避免刺伤神经根，从而建立神经根非压迫性损伤模型。造模完成后，在造模术后当天及第2、4天肌注青霉素G 33000 U/kg，预防术后感染。将实验动物继续常规饲养，密切观察其一般情况及活动时肢体情况。

1.3.2 微创介入治疗造模成功14天后，将实验猪随机分为实验组(消炎液治疗)与对照组(生理盐水治疗)。同样用上述方法麻醉、磁共振检查及CT导向下穿刺实验动物L2～3、L3～4、L4～5双侧椎间孔。在实验组动物每根神经根周围注射消炎液10 mL(曲安奈德120 mg、利多卡因30 mL、维生素B12 6 mg制成溶液共约72 mL)，在对照组动物每根神经根周围注射生理盐水10 mL。同样用造模术后的方案肌注青霉素G预防术后感染及密切观察动物情况。

1.4 神经根组织免疫组化检查

1.4.1 标本取材两组随机各取1只试验猪于相应取材时间点(治疗后3、7、14 d)再次按前述方法麻醉及磁共振检查后，麻醉状态下处死并解剖出L2～3、L3～4、L4～5双侧神经根近段，然后置于4%多聚甲醛固定液并标记。取材方法：持续麻醉状态下，采用仰卧位，将实验动物固定于手术台上，沿左侧胸骨旁线剪开胸壁，充分暴露心脏并钝行分离心包，于心尖向左心室内快速注射100 mL生理盐水，然后剪开右心耳，再次于心尖快速注射生理盐水100 mL及10%中性甲醛固定液200 mL。使甲醛固定液通过血液循环快速到达神经根周围。待动物呼吸心跳停止后，将动物取俯卧位，逐层剥离腰背部皮肤、肌肉并取去T11～L5节段脊柱，再用骨钳咬断L1～5双侧椎板，从后方打开椎管并充分暴露脊髓及双侧神经根，分别剪取7～10 mm L2～3、3～4、4～5双侧神经根近段，并固定、标记送免疫组化检查。

1.4.2 免疫组化(S-P法) ①一抗：TNF-α，兔多克隆抗体，批号：ab6671，英国abcam--艾博抗(上海)贸易有限公司。②二抗：生物素化山羊抗兔IgG(H+L)，批号：13152A11，北京中杉金桥生物有限公司。③三抗：辣根酶标记链霉素卵蛋白素(HRP/A-V)，批号：13152A11，北京中杉金桥生物有限公司。④封闭用正常山羊血清，批号：13152A11，北京中杉金桥生物有限公司。⑤显色剂：浓缩型DAB试剂盒，批号：K135925C，北京中杉金桥生物有限公司。

1.4.3 免疫组化步骤先将载玻片防脱片处理、切片常规脱蜡至水、热修复抗原，然后滴加山羊血清封闭液，室温20 min；再滴加稀释的一抗(1：200)，4℃过夜；再滴加二抗，37℃ 30 min；再滴加三抗，37℃ 30 min。经DAB室温显色2 min，蒸馏水洗涤后苏木素轻度复染，脱水，透明，中性树胶封片。

1.4.4 免疫组化图像采集及评价采用BA200Digital数码三目摄像显微摄像系统对切片进行400倍图像采集。神经根TNF-α蛋白的平均光密度测定使用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统。

1.5 统计学分析运用IBM SPSS Statistics Ver.21统计软件，采用一维组间方差分析(one way ANOVA)统计方法进行数据处理和分析。先分别比较两组实验动物组间及组内造模前、治疗前、治疗后各时间点神经根平均FA值的差异及变化；再分别比较两组治疗后不同时间点组内神经根TNF-α蛋白含量变化及相同时间点组间神经根TNF-α蛋白含量差异。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 神经根平均FA值

2.1.1 造模前后两组神经根平均FA值造模前实验组神经根平均FA值为(0.476±0.150)，对照组神经根平均FA值为(0.394±0.115)。两组间造模前神经根平均FA值比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。造模后实验组神经根平均FA值为(0.214±0.084)，对照组神经根平均FA值为(0.180±0.061)；两组间造模后神经根平均FA值比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。与造模前相比，两组实验对象造模后神经根平均FA值均出现减小(P<0.05)。

表1 造模前两组实验猪神经根平均FA值表Table 1 Average FA values of nerve roots in the two groups before modeling

表2 造模后两组实验猪神经根平均FA值表Table 2 Average FA values of nerve roots in the two groups after modeling

2.1.2 治疗后各时间点两组神经根平均FA值与治疗前(造模后)相比，实验组治疗后3、7、14 d神经根平均FA值均升高(P<0.05)，且与造模前比较差异无统计学意义(P>0.05)；而对照组治疗前后神经根平均FA值比较差异无统计学意义(P>0.05)；治疗后各时间点实验组神经根平均FA值均较对照组高(P<0.05)，见表3。

表3 治疗后两组实验猪神经根平均FA值表Table 3 Average FA value of nerve root in the two groups after treatment

2.2 治疗后两组各时间点神经根TNF-α蛋白含量与治疗后3天相比，实验组治疗后7、14 d神经根TNF-α蛋白含量降低(P<0.05)；而对照组治疗后3、7、14 d神经根TNF-α蛋白含量比较差异无统计学意义(P>0.05)；治疗后7、14 d实验组神经根TNF-α蛋白含量均较对照组明显降低(P<0.05)，见表4、图1。

表4 治疗后两组实验猪神经根TNF-α平均光密度表Table 4 The mean optical density of TNF-α in nerve roots of the two groups after treatment

图1 神经根DTI测值及免疫组化图Figure 1 DTI and immunohistochemistry of nerve roots注：A.对照组治疗前FA值；B.实验组治疗前FA值；C.对照组治疗后7天L4～5右侧神经根HE染色图；D.对照组治疗后7天FA值；E.实验组治疗后7天FA值；F.实验组治疗后7天L4～5右侧神经根HE染色图

3 讨论

传统研究认为腰椎神经根性疼痛的原因是由腰椎间突出的机械压迫导致的，然而近年来的研究认为，神经根性疼痛除了机械压迫，还包括非压迫性因素[1-3]。Marshall[8]首次提出化学性神经根炎是由于纤维环破裂和椎间盘液沿神经根鞘扩散而引起的神经根炎症。Sun等[9]进一步研究认为椎间盘髓核属于无血液供应组织，独立于人体免疫系统之外，在体内具有免疫原性，椎间盘突出患者中，由于纤维环断裂髓核组织突出于椎管内，从而暴露于免疫系统中可导致自身免疫反应，从而导致化学性炎症。Peng等[10]通过非压迫性神经根痛的临床病例证实，化学性神经根炎所致临床病理疼痛现象存在。因此影像检查中突出的椎间盘未压迫神经根，而临床出现神经病理性疼痛，神经根组织免疫组化检查中也出现炎性反应及炎症因子即能诊断该疾病。同时，有研究表明，髓核组织本身就含有多种致炎因子，包括TNF-α、IL-1a等，其中TNF-α在炎症的发生过程中扮演重要作用，神经病理性疼痛与其浓度高低呈正相关[11-12]。神经根受压的无疼痛患者神经根FA值反而无变化[13]，表明神经根FA值可能是阐明神经根病病理机制的潜在工具。本研究以神经根中TNF-α蛋白含量为参考标准，以反映神经根炎治疗过程中的转归及与神经根平均FA值的相对应关系，从而评价非压迫性腰椎神经根炎消炎液微创治疗的疗效。

Balbi等[14]研究表明腰椎椎间盘突出患者受压患侧神经根较健侧及健康志愿者相对应节段神经根FA值减低。本研究同样发现造模后FA值较减低，推测其原因可能是由于神经根暴露于髓核组织中发生自身免疫性炎症、化学性炎症，神经发生沃勒变性，神经髓鞘及外周多层膜结构的完整性被破坏、通透性增加，水分子在神经横轴方向扩散运动增加，神经根的各向同性增加，各向异性减小，因此FA值降低[15]；治疗后神经的远端轴索再生、新生的轴索密度增加，水分子在神经纵行方向扩散运动增加，FA值也随之升高[16]。

细胞因子是一类由多种细胞产生并分泌到胞外的糖蛋白分子，具有多种生物学功能，其中TNF-α在根性神经痛方面发挥重要作用。神经根发生自身免疫性炎症及化学性炎症后，各种炎性细胞因子及其他炎症介质的参与，导致神经根TNF-α蛋白含量增高[17]。本实验中用自体髓核造模诱发神经根炎后，将消炎液注入神经根周围治疗，主要治疗药物是曲安奈德，为肾上腺皮质激素类药，该类药品用于治疗腰椎神经根性疼痛得到广泛认可，其机制可能为减少前列腺素的合成，维持细胞膜的稳定，从而抑制痛觉C纤维的传导冲动[18]；同时也有助于神经根损伤的修复，通过调节合成bFGF，从而促进神经根功能的恢复，还能降低毛细血管的通透性，减轻水肿，抑制炎症浸润，从而使 TNF-α的合成和释放减少[19]。有研究证实神经根鞘内外局部使用糖皮质激素治疗后血液中TNF-α明显降低[20]；而且曲安奈德也能有效治疗神经损伤后的根性疼痛[21]。

有研究表明神经根FA值与TNF-α平均光密度存在负相关关系[22]。Eguchi 等[23]通过研究腰椎间盘突出症患者发现受压迫神经FA均值明显低于未损伤神经，术后患处神经根FA值显著升高，且FA值和神经症状的严重程度之间存在很强的相关性。本实验研究结果也印证了消炎液治疗后神经根TNF-α蛋白含量均较对照组明显降低，神经根的FA值也较治疗前及对照组升高，且与造模前比较差异无统计学意义(P<0.05)。这提示扩散张量成像可用于非压迫性椎间盘突出所致神经根自身免疫性炎症、化学性炎症以及治疗后炎症转归的评估[24]，并能提供定量信息以评估神经根完整性及病理生理改变[25]，同时腰椎非压迫性神经根炎能在此种配伍的消炎液微创治疗中获益。

本研究的不足之处：①仅对每只实验动物相邻节段的多组神经根同时进行实验，可能会造成相互干扰，对实验数据造成影响。②实验动物样本量较少，且部分神经根为同一实验对象，统计结果可能会有偏差。③FA值ROI的放置可能会受人为的测量误差影响。④只使用一种消炎液的配伍，未对其他配伍的药物进行比较。⑤本研究为动物实验研究，未对实验对象痛觉、行动能力等主观治疗转归进行评估。