二甲双胍与胃癌细胞的增殖、迁移及上皮-间充质转化之间的关系*

2022-04-16王文婷胡杨志张芡胡志立刘力邓祖亮

西部医学 2022年4期

王文婷胡杨志张芡胡志立刘力邓祖亮

(湘南学院附属医院，湖南郴州 423000)

在世界范围常见肿瘤中胃癌患病率排名第四位，致死率排名第二[1-2]。研究[3]显示，胃癌的5年生存率很低，转移是胃癌预后不良的主要原因之一。上皮-间充质转化(Epithelial-mesenclymal transformation，EMT)是肿瘤细胞转移的关键步骤。EMT在胃癌的发生和发展过程中起着至关重要的作用。二甲双胍，也称为1，1-二甲基双胍盐酸盐，是FDA批准临床治疗2型糖尿病的药物；且二甲双胍能够调节细胞能量代谢，与肿瘤的发病率和死亡率降低相关[4-5]。研究[6-7]显示，在乳腺癌患者中辅助化疗联合二甲双胍可以提高治疗的完全病理反应率。因此，本研究旨在探讨二甲双胍在胃癌过程中的生物学功能，并试图探讨其是否参与调节胃癌细胞的增殖、迁移及上皮-间充质转化。

1 材料与方法

1.1 细胞培养与二甲双胍溶液配制实验细胞选用胃癌细胞系AGS细胞，购自美国ATCC。细胞培基为含有10%胎牛血清及1%青链霉素混合液的高糖DMEM培养基。培养条件：37℃，5%CO2的恒温培养箱。试验中处理细胞所用的二甲双胍购自中国碧云天生物，在操作台上用PBS溶解成400 mmol/L保存液，用无菌注射式过滤器过滤，分装-20℃保存。用不同浓度(0、10、20、40 mmol/L)的二甲双胍处理胃癌细胞，将细胞分为对照组、二甲双胍处理组(10、20、40 mmol/L)。

1.2 细胞形态及增殖评估取生长状态良好的胃癌细胞按每孔1×106个接种至6孔板中，用不同浓度二甲双胍(0、10、20、40 mmol/L)处理24 h，弃去培养基用PBS清洗2～3次。用结晶紫染色液对胃癌细胞进行染色，处理30 min弃去染色液，用PBS清洗2～3次后置于倒置显微镜下进行拍照，观察细胞在不同浓度二甲双胍处理下的细胞密度和状态。用CCK-8试剂盒(碧云天生物，中国)检测胃癌细胞增殖活性。取生长状态良好的胃癌细胞，按1×103/孔的密度接种于96孔板，在37℃下培养24 h后进行二甲双胍(10、20、40 mmol/L)处理。处理24 h后，将CCK-8试剂加入每个含有孔的细胞中，培养2 h，然后在450 nm处测量吸光度。实验重复三次。

1.3 细胞迁移评估采用划痕实验评价胃癌细胞迁移能力。收集二甲双胍(0、10、20、40 mmol/L)处理后的胃癌细胞并重新植入6孔板中。让细胞在37℃下生长，直到100%融合，然后用移液管在细胞层上小心地划出一道划痕。在划痕后0、24 h分别对细胞生长状况进行显微镜拍照。

1.4 Western blot检测蛋白水平不同浓度二甲双胍(10、20、40 mmol/L)处理后的胃癌细胞PBS清洗2～3次，冰上用RIPA进行裂解得到总蛋白。处理后的胃癌细胞在RIPA缓冲液中裂解后得到总蛋白。用蛋白浓度监测仪imagequantlas Q5000(美国夸威尔)测定提取总蛋白的浓度。将相同量的蛋白质煮沸，用SDS-PAGE方法溶解，然后转移到PVDF膜上。用5%脱脂牛奶封闭PVDF膜1 h，然后用TBST清洗3次，用一级抗体(1:1000)在4℃下培养过夜。在我们的研究中，免疫印迹用以下抗体进行：E-cadherin(英国abcam，1:1000)、vimentin(英国abcam，1:1000)、GAPDH(abcam，英国，1:1000)。然后用TBST清洗PVDF膜3次，共30 min，辣根过氧化物酶结合的二级抗体(1:2000)孵育1 h。用TBST清洗三次，每次10 min。用imagequantlas500(美国通用电气公司)对薄膜进行化学发光检测，并用NIH-Image-J软件测量其条带密度。

2 结果

2.1 二甲双胍抑制胃癌细胞增殖活性倒置显微镜拍照显示，二甲双胍可以抑制胃癌细胞的密度逐渐降低，且呈浓度依赖性(P<0.0001)，见图1、表1。CCK8检测细胞增殖活性结果显示，与对照组比较，二甲双胍处理组随浓度增加增殖水平显著降低，呈浓度依赖(F=27.22，P<0.0001)，见图2。

图2 不同浓度二甲双胍对胃癌细胞增殖的影响Figure 2 The effect of different concentrations of metformin on proliferation in gastric cancer cells注：与对照组相比，①P<0.05

表1 二甲双胍对胃癌细胞增殖的影响Table 1 Effect of metformin on proliferation of gastric cancer cells

图1 不同浓度二甲双胍对胃癌细胞增殖的影响Figure 1 The effect of different concentrations of metformin on proliferation in gastric cancer cells

2.2 二甲双胍抑制胃癌细胞的迁移使用不同浓度(10、20、40 mmol/L)的二甲双胍溶液处理胃癌细胞，结果显示：二甲双胍处理的胃癌细胞的迁移显著减慢，且呈浓度依赖性，浓度越大胃癌细胞的迁移越慢(P<0.0001)，见图3。

图3 不同浓度二甲双胍对胃癌细胞迁移的影响Figure 3 The effect of different concentrations of metformin on the migration of gastric cancer cells注：与对照组相比，①P<0.05

2.3 二甲双胍抑制胃癌细胞的上皮-间充质转换检测不同浓度二甲双胍处理胃癌细胞时，胃癌细胞的E-cadherin和vimentin蛋白表达情况结果显示，二甲双胍处理胃癌细胞，显著降低vimentin蛋白水平，增加E-cadherin蛋白的表达水平，均呈浓度依赖性(均P<0.01)，见图4。提示二甲双胍可以抑制胃癌细胞的上皮间质转换，对胃癌的进程可能有一定的抑制作用。

图4 不同浓度二甲双胍对胃癌细胞E-cadherin和vimentin蛋白表达的影响 Figure 4 The effect of different concentrations of metformin on the expression of E-cadherin and vimentin proteins in gastric cancer cells注：与对照组相比，①P<0.05

3 讨论

在全世界范围内胃癌是一种致命的疾病，生存率很低，每年新诊断的胃癌主要发生在亚洲和南美国家[8]。在美国，至2020年有27000个新病例出现[9]。在发展中国家，胃癌对人口的影响要严重得多。然而，进展期和转移性胃癌的生存率非常低，攻克这项疾病还很困难。

二甲双胍作为2型糖尿病的降糖药物已经使用了很长时间，可以作为单一疗法或与其他降糖尿药物联合使用[10]。1995年英国进行的一项具有里程碑意义的前瞻性糖尿病研究(UKPDS)证实了二甲双胍对心血管系统的长期益处[11]。近期，二甲双胍已用于各个方面的实验性研究，如生殖医学、肿瘤化疗、代谢性疾病和神经退行性疾病。评估二甲双胍在肿瘤治疗中的相关性研究，关于其抗肿瘤作用，人们提出了不同的机制，包括激活单磷酸腺苷激酶、调节腺苷A1受体、减少胰岛素/胰岛素生长因子，以及二甲双胍在抑制内源性活性氧中的作用，此外其对DNA分子的损伤是另一个重要的抗肿瘤机制。关于盐酸二甲双胍抗肿瘤的研究[12]表明，二甲双胍一定程度上能够抑制肺癌、乳腺癌及消化系统肿瘤的发生与发展。本研究证实二甲双胍可能降低胃癌中胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力。

上皮-间充质转化(EMT)在包括胃癌在内的肿瘤的发生、发展中起着重要作用。在EMT过程中，上皮细胞的各种生化变化会导致细胞极性和迁移能力的丧失，从而导致细胞形态的改变，促使静止的上皮细胞向运动的间充质细胞转化，最终加强细胞的转移[13]。据报道，EMT可导致多种肿瘤的病理迁移和侵袭，其诱发的癌变是胃癌、颈部鳞状细胞癌和卵巢癌等恶性肿瘤的常见原因[14]。EMT是胚胎发育和器官发生过程中细胞重塑的关键过程，参与了肿瘤的发生，并通过增强侵袭性和移动性赋予癌细胞转移特性[15-16]。研究[17]发现，促进EMT过程的分子机制包括调节特定细胞表面蛋白水平、细胞外基质降解酶和改变某些转录因子的表达。我们检测了与EMT密切相关的生物标记物E-cadherin和vimentin的表达水平，结果显示二甲双胍可以显著降低胃癌细胞中E-cadherin和vimentin蛋白水平，且呈浓度依赖性。近年来，有研究[18]表明大蒜素与IL-33均能抑制胃癌细胞间充质转化进而抑制胃癌细胞的侵袭与迁移。基于以上结果，我们认为二甲双胍可能通过诱导EMT促进胃癌的侵袭和迁移。

研究[19]发现，基质金属蛋白酶(MMPs)能降解上皮细胞重要标志物E-cadherin。EMT的延长与MMP-2活性和MMP-9分泌水平有关，MMPs能够通过PI3K/AKT通路影响E-cadherin表达调节在包括胃癌在内的多种肿瘤中对EMT的作用[20]。此外，据报道，Wnt/β-catenin信号通路在EMT中起着重要作用。在EMT过程中，E-cadherin的丢失可能会异常激活Wnt/β-catenin信号通路，然后抑制β-catenin的降解，进入细胞核促进Myc等下游靶基因的表达，最终促进肿瘤细胞的侵袭和迁移[21]。这与我们的研究结果一致，E-cadherin和vimentin的表达抑制影响了胃癌细胞的侵袭和转移。