1例输入性罕见远期复发卵型疟原虫多重感染的实验室检测分析

薛卫斌，王浩园，张婷婷，蒋莉娟，蒋一斓，罗福康△

1.重庆市第九人民医院医学检验科，重庆 400700；2.西南大学医学研究院，重庆 400700

卵形疟原虫(Plasmodium ovale)是4种主要人体疟原虫之一，其分布范围较小，主要在热带西非流行，通过受感染的按蚊(Anopheles)叮咬传播[1-2]。卵型疟原虫感染导致的疟疾(简称卵型疟)在我国极为罕见，近年来随着跨境人流量的增加，输入性病例数量有所上升，我国输入性疟疾病例主要来源于非洲，占87.81%，且以恶性疟疾为主[3]。由于卵形疟原虫的形态、感染的发作周期、再燃和复发机制都与间日疟原虫极为相似，并且因复发卵形疟患者的原虫密度又较低[4-5]，因此要作出正确的诊断难度大，也容易漏诊和误诊。笔者对重庆市第九人民医院(下称本院)收治的1名输入性卵形疟远期复发的患者采用了几种实验室诊断方法进行检测，最终确诊，现报道如下。

1 资料与方法

1.1临床资料 患者为男性，汉族，46岁，四川省泸县人。2021年5月18日，自觉不适，畏寒、发热；此症状隔日发作，并逐渐出现乏力、活动后气促，于2021年5月22日发作后于本院进行治疗。入院时体温40 ℃，呼吸23次/分，心率144次/分，血压141/87 mm Hg。神志清楚，精神一般，对答切题，全身浅表淋巴结未扪及，肝、脾肋下未扪及。

患者既往病史：2016年6月至2019年3月，患者曾在位于非洲中部西海岸的加蓬共和国工作，为初次发病。在当地进行了检查疟疾快速诊断试剂盒(RDTs)检测为阳性，T1、T2阳性情况未知，形态学检查未做，当地医生结合症状诊断为恶性疟原虫感染导致的疟疾(简称恶性疟)，用喹啉、青蒿琥酯抗疟治疗，并用其他药物进行了对症辅助治疗。3 d后患者病情好转，于是停药。几个月后，患者又出现疟疾症状，自行服用抗疟药物(药物名称不详)后好转，病情有反复。2019年下半年回国，直到2020年3月才再次出现症状，患者未立即就医，而是自行服用复方蒿甲醚本芴醇治疗，然后好转。

辅助检查：2021年5月22日血常规检查显示，红细胞计数4.48×1012/L，血红蛋白137 g/L，血小板计数120×109/L，白细胞计数7.82×109/L，中性粒细胞百分数85.9%，淋巴细胞百分数8.4%，超敏C反应蛋白36.8 mg/L，总蛋白62.5 g/L，清蛋白36.5 g/L。超敏肌钙蛋白、B型脑钠肽、甲型流感病毒抗原和乙型流感病毒抗原的检测结果均为阴性。因患者既往有疟疾病史，于是行血液疟原虫镜检，结果为阳性，并提示可见小滋养体、配子体，虫种暂时未知。

1.2方法

1.2.1复查血常规 将患者5月22日的血常规标本，使用Sysmex公司XN-3100全自动血液分析流水线系统及原装配套试剂进行血常规项目的复检。

1.2.2RDTs检测 使用万孚疟原虫检测试剂盒进行检测，严格按说明书进行操作。

1.2.3显微镜镜检 用Sysmex SP-50全自动血涂片制备仪制备厚、薄血涂片并进行瑞-姬染色，再通过奥林巴斯CX-43型号的显微镜进行观察，并用MShot Image Analysis System软件拍照进行记录。

1.2.4疟原虫巢式PCR和一代测序检测 采集1管患者的静脉全血标本，使用巢式PCR结合一代测序技术来鉴定疟原虫的虫种及亚型。根据参考文献[6]，合成鉴定疟原虫属的通用引物(rPLU)和4种疟原虫(P.falciparum、P.malariae、P.vivax、P.ovale curtisi、P.ovale wallikeri)的特异性引物(分别为rMAL、rVIV、rOVA、rOVAv)，见表1，引物均由北京擎科生物科技有限公司重庆分公司合成。采用血液DNA小量提取试剂盒提取患者外周血DNA。巢式PCR第一轮PCR扩增体系(25 μL)包括2×T5 Direct PCR Mix(血液)12.5 μL，rPLU正、反向引物各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。第一轮扩增程序为98 ℃预变性3 min；98 ℃变性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，一共进行35个循环；72 ℃最后延伸3 min，4 ℃保存扩增产物。然后对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳(1.5%琼脂糖)。巢式PCR第二轮扩增体系(25 μL)包括2×T5 Direct PCR Mix(血液)12.5 μL，特异性正、反向引物各1 μL，DNA模板(为第一轮扩增产物)2 μL，ddH2O 8.5 μL。第二轮扩增程序和第一轮相同。对第二轮巢式PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(1.5%琼脂糖)。采用FastPure®Gel DNA Extraction Mini Kit试剂盒切胶回收第二轮扩增的目标条带。测序PCR扩增体系(10.3 μL)包括特异性反向引物1 μL，测序缓冲液1.9 μL，BigDye一代测序试剂(BDT)0.5 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 4.9 μL。测序PCR扩增程序为96 ℃预变性1 min，96 ℃变性10 s，50 ℃退火5 s，60 ℃延伸4 min，共进行25个循环；4 ℃保存。采用磁珠法纯化测序PCR产物，将纯化后的测序PCR产物13 μL上机测序(使用的测序仪型号为ABI 3500)。使用NCBI在线比对工具nBlast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)将一代测序的结果与其核酸数据库进行比对，判断疟原虫类型。

表1 疟原虫巢式PCR检测的引物序列及扩增片段大小

2 结 果

2.1血常规复查的结果 血常规结果与初次结果基本相符，但Q-Flag报警提示有受感染的红细胞(iRBC)；WDF通道的散点图，位于中性粒和嗜酸性粒细胞散点群之间，集中在中性粒细胞散点群下方有一群异常散点群；WNR通道的散点图，位于白细胞散点群左下方的区域也出现一群异常散点群，见图1。

注：A为WDF通道散点图；B为WNR通道散点图；圈内为仪器检测中显示为浅紫色的异常散点群。

2.2RDTs检测 结果为T2阳性，根据说明书的解释，提示感染除恶性疟原虫以外的其他3种疟原虫中的单种或多种。

2.3形态学检查 查见卵形疟环状体,见图2A；查见大滋养体，见图2B；查见雌配子体，见图2C；查见雄配子体，见图2D；查见多重感染形态，见图2E、2F。

注：A中箭头所指为卵形疟环状体；B中箭头所指为卵形疟大滋养体； C中箭头所指为卵形疟雌配子体；D中箭头所指为卵形疟雄配子体；E中箭头所指为卵形疟多重感染；F中箭头所指为卵形疟多重感染。

2.4巢式PCR电泳及一代测序结果 第一轮巢式PCR扩增产物电泳图，见图3A，产物大小为1 200 bp，与目标条带大小相符，说明该患者有疟原虫属的感染。第二轮巢式PCR扩增产物电泳图，见图3B，产物大小为778 bp，与预期相符，说明该患者感染的疟原虫类型属于P.ovlae curtisi。第二轮巢式PCR产物的一代测序结果及NCBI在线比对工具验证了该患者感染的疟原虫属于P.ovlae curtisi亚种，与形态学检测结果一致。

注：A为第一轮巢式PCR产物电泳图；B为第二轮巢式PCR产物电泳图；泳道1是分子标准条带；泳道2为由患者外周血DNA标本扩增得到的产物。

2 讨 论

因WDF溶血剂作用较弱，疟原虫感染的红细胞不会被溶血剂破坏。故不同感染阶段的红细胞对WDF散点图的干扰也不同，疟原虫小滋养体期感染红细胞内容物的复杂程度和细胞体积小于中性粒细胞，核酸含量与中性粒细胞类似，但其细胞内容物的复杂程度和核酸含量小/少于嗜酸性粒细胞，这一部分感染的红细胞在散点图上会出现在中性粒细胞和嗜酸性粒细胞之间的区域[7-10]。WNR溶血剂作用强于WDF溶血剂，可破坏被疟原虫感染的红细胞膜，使其细胞变为含有疟原虫的裸核，裸核的体积和核酸含量均低于白细胞，也不会干扰白细胞的计数和嗜碱性粒细胞的计数[7-10]。有研究表明，万孚疟原虫检测试剂盒对卵形疟原虫的总体检出率为70.0%，其检出率与原虫密度、疟原虫乳酸脱氢酶(pLDH)浓度关系密切，与pLDH基因多态性无关[11]。

卵形疟环状体与间日疟较相似，细胞质较大呈淡蓝色环状，约为红细胞直径的1/3，1个红核。卵形疟大滋养体与三日疟较相似，红细胞稍显肿胀，边缘整齐或不规则样；虫体小于正常红细胞，呈圆形、带状或大环状，但较大。卵形疟雌配子体与三日疟和间日疟相似，感染虫体的红细胞涨大，一般呈卵圆形或者椭圆形，呈“彗星”样或伞状[5]；虫体圆形，胞质深蓝色，核结实并偏于一侧，虐色素多而分散，被感染的红细胞形态稍规则，并略大于正常红细胞，虫体红核蓝浆，胞核偏于一侧明显，核染色质致密，细胞质几乎胀满整个红细胞。雄配子体与雌配子体的形态大致相同，主要区别在于雄配子体的胞核位于中央，而雌配子体的胞核偏于一侧。卵形疟通常寄生于红细胞内的原虫只有1个，偶有2个(多重感染)，而此病例中，多次查到有2个以上的原虫寄生于1个红细胞内的形态，是典型的多重感染，红细胞呈卵圆形稍肿大和褪色；仔细观察有4个虫体寄生在内，实属罕见；而被感染的红细胞胀大且不规则，褪色明显，内含有大、小滋养体及未成熟裂殖体，更是罕见。

巢式PCR技术在第一轮扩增产物的电泳结果出来后，条带大小与预期相符，证明是疟原虫属疾病；第二轮电泳结果显示P.ovale curtisi 亚型的特异性序列被扩增出来，证明引物序列可靠，并初步判断该疟原虫类型属于P.ovale curtisi 亚型；nBlast比对结果分数越高，E值(Expect value)越小，同源性越高；因此可知此样本的DNA序列与卵形疟的序列相似程度较高，最终判断该样本是卵形疟P.ovale curtisi亚型[12]。最后，重庆市疾控中心也确诊此病例为卵形疟。

抗疟药使用应遵循安全、有效、合理、规范的原则。应根据疟原虫虫种及其对抗疟药的敏感性和患者的临床症状与体征合理选择药物，并应严格掌握剂量、疗程和给药途径，以保证治疗和预防效果并延缓抗药性的产生[13]。所以能否快速明确诊断出疟原虫的虫种及其重要。

Sysmex血液分析仪的iRBC和寄生虫感染红细胞(pRBC)的报警值得高度警惕，很有必要建立在血常规的复检规则中，以防止疟原虫的漏检；戴燕等[14]曾经报道，对异常散点图的分析，也可快速、简便的筛查疟原虫，也可防止疟原虫的漏检；RDTs操作方便，判读结果快，但对检测非恶性疟的特异性不强，可作为镜检法鉴别虫种的辅助工具[15]；KOTEPUI等[16]也曾报道，通过形态学方法将卵形疟误认为间日疟是很常见的，并导致全世界卵形疟原虫病例的报告不足，但形态学检查任然是诊断疟疾及其虫种的最理想且廉价的方法；巢式PCR和一代测序技术特异性好，准确率高，尤其对鉴别虫种亚型有着很好的适用性，但其设备昂贵，无法配备所有基层实验室；实验室的工作人员与医生和患者的沟通也很重要，可联系临床资料得到正确的诊断方向。

对此罕见病例，本实验室利用现有条件对其进行了多种方法诊断，以形态学的诊断最为迅速、准确且廉价，其他方法各有优劣，适合对其进行辅助鉴别诊断。根据2015年WHO发布的《疟疾治疗指南》(第三版)中的建议，实验室常规检查方法推荐形态学和RDTs联合检测[17]，所以加强基层实验室人员对疟原虫理论及形态学的培训尤为重要。