不同栽培土壤种植灵芝中主要成分的比较分析

汪戎锦，张鸿旭，武家杰，于晓风，睢大筼，门丽慧

（1.吉林大学药学院，长春 130021；2.吉林大学基础医学院，长春 130021）

灵芝[Ganodermalucidum(Leys.ex Fr.)Karst]为担子菌纲(Basidiomycetes)，多孔菌科(Polyporaceae)，灵芝亚科(Ganodermatoideae)，灵芝属(Ganoderma)真菌。具有扶正固本、滋阴强壮、补中益气、延年益寿等功效，被列为上品，在民间享有“仙草”之美誉。我国灵芝作为药材使用已有几千年的历史，《中华人民共和国药典》[1]中收入作为药材灵芝来源的为赤芝[Ganodermalucidum(Leys.ex Fr.)Karst]或紫芝[Ganodermajaponicum(Fr.)Lloyd]的干燥子实体。灵芝子实体所含活性成分较为复杂，目前已分离得到百余种化学成分，包括多糖类、三萜及甾醇类、氨基酸类、多肽类、蛋白类、核苷类、生物碱类、挥发油类以及多种微量元素等[2-6]。国内外研究表明，灵芝主要活性成分具有多种药理作用，包括抗肿瘤、抗氧化、降血糖、免疫调节、抗菌、抗病毒、抗衰老以及保肝等功效[7-10]。灵芝产业是白色现代农业，符合低碳经济的发展方向，是一个不与人争粮、不与粮争地、不与地争水、不与环境排污染、不与其它产业争资源、低能耗可持续发展的行业，已成为农业增产、农民争收的优势产业。随着人参、鹿茸等名贵药材成为吉林省的一大特色产业，长白山灵芝产业也蓄势待发。

目前，灵芝种植均采用种植一年更换新地，或在原有土地加一层山沙土，严重破坏了自然环境。为解决灵芝在栽培中的土地资源、染菌、不能连种等问题，本课题组受吉林省重点科技研发项目资助，在吉林省蛟河市黄松甸镇南顶子建立一栋168平方米的标准灵芝栽培大棚，内含4个28平方米试验单元，间隔4米平方。分别以山核桃壳、玉米芯和玉米秸秆（均为20目粗粉）作为土壤，另设一个传统山沙土。旨在解决土地资源问题，也减少山核桃壳、玉米棒及玉米秸秆的废弃污染，从而变废为宝。经过三年研究，培育出与山沙土一样的灵芝子实体。鉴于灵芝发挥药理作用的主要药效成分为多糖和三萜类成分[11]，因此本论文采用2020版《中国药典》中的检测方法，对4种不同土壤所栽培的灵芝中所含多糖、三萜及甾醇类化学成分进行提取并检测其含量，结合几种灵芝样本的含水量及浸出物含量分析及经济性状比较，探讨不同栽培土壤条件是否对灵芝的质量产生影响，从而为灵芝的质量检测及栽培条件选择提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 药材、试剂及仪器

药材来源于4批不同土壤栽培的灵芝子实体样本，分别为山核桃壳（1号）、山沙土（2号）、玉米芯（3号）及玉米秸秆（4号），由吉林昆阆医药有限公司提供；齐墩果酸标准品（上海融禾医药科技有限公司）；乙醇（吉林省运昌化工有限公司）；甲醇为色谱纯（美国Fisher公司）；葡萄糖、冰醋酸、浓硫酸、高氯酸均为分析纯（北京化工厂）；香草醛（惠世生化试剂有限公司）；蒽酮（天津科密欧化学试剂有限公司）。

DFT-200手提式高速万能粉碎机（温岭市林大机械有限公司）；SHZ-Ⅲ型循环水真空泵（上海亚荣生化仪器厂）；Milli-QGradient A10超纯水系统（美国Millipore Inc.）；真空旋转蒸发仪（上海申生科技有限公司）；酶标仪（SpectraMax）；TG16-WS台式高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；Q-New Classic MF十万分之一电子天平（METTLER TOLED）；KQ-500DE超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；真空干燥箱DZF-6020型（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；KDM型调温电热套（山东鄄城华鲁电热仪器有限公司）；SHHW21420型三用电热恒温水箱（余姚市东方电工仪器厂）。

1.2 实验方法

本研究采用2020版《中国药典》中的检测方法对灵芝主要成分及各项指标进行检测。

1.2.1 灵芝三萜及甾醇含量测定

1.2.1.1 对照品溶液的制备

取齐墩果酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml含0.2 mg的溶液，即得。

1.2.1.2 供试品溶液的制备

取本品粉末约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加乙醇50 ml，超声处理（功率140 W，频率42 kHz）45分钟，滤过，滤液置100 ml量瓶中，用适量乙醇，分次洗涤滤器和滤渣，洗液并人同一量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，即得。

1.2.1.3 标准曲线的制备

精密量取对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 ml，分别置15 ml具塞试管中，挥干，放冷，精密加入新配制的香草醛冰醋酸溶液（精密称取香草醛0.5 g，加冰醋酸使溶解成10 ml，即得）0.2 ml，高氯酸0.8 ml，摇匀，在70℃水浴中加热15分钟，立即置冰浴中冷却5分钟，取出，精密加入乙酸乙酯4 ml，摇匀，以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法（通则0401），在546 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标绘制标准曲线。

1.2.1.4 检测方法

精密量取供试品溶液0.2 ml，置15 ml具塞试管中，照标准曲线制备项下的方法，自“挥干”起，同法操作，测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中齐墩果酸的含量，计算，即得。每种栽培土壤取两批灵芝样本进行检测，每批样本平行检测3次。

1.2.2 灵芝多糖含量测定

1.2.2.1 对照品溶液的制备

取无水葡萄糖对照品适量，精密称定，加水制成每1ml含0.12mg的溶液，即得。

1.2.2.2 供试品溶液的制备

取本品粉末约2g，精密称定，置圆底烧瓶中，加水60ml静置1小时，加热回流4小时，趁热滤过，用少量热水洗涤滤器和滤渣，将滤渣及滤纸置烧瓶中，加水60ml，加热回流3小时，趁热滤过，合并滤液，置水浴上蒸干，残渣用水5ml溶解，边搅拌边缓慢滴加乙醇75ml，摇匀，在4℃放置12小时，离心，弃去上清液，沉淀物用热水溶解并转移至50ml量瓶中，放冷，加水至刻度，摇匀，取溶液适量，离心，精密量取上清液3ml，置25ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。

1.2.2.3 标准曲线的制备

精 密 量 取 对 照 品 溶 液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml，分别置10ml具塞试管中，各加水至2.0ml，迅速精密加入硫酸蒽酮溶液（精密称取蒽酮0.1g，加硫酸100ml使溶解，摇匀）6ml，立即摇匀，放置15分钟后，立即置冰浴中冷却15分钟，取出，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法（通则0401），在625nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.2.2.4 测定方法

精密量取供试品溶液2ml，置10ml具塞试管中，照标准曲线制备项下的方法，自“迅速精密加入硫酸蔥酮溶液6ml”起，同法操作，测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中无水葡萄糖的含量，计算，即得。每种栽培土壤取两批灵芝样本进行检测，每批样本平行检测3次。

1.2.3 灵芝浸出物及水分含量检测

1.2.3.1 水分含量检测

取供试品2~5 g，平铺于干燥至恒重的扁形称量瓶中，厚度不超过5 mm，疏松供试品不超过10 mm，精密称定，开启瓶盖在100~105℃干燥5小时，将瓶盖盖好，移置干燥器中，放冷30分钟，精密称定，再在上述温度干燥1小时，放冷，称重，至连续两次称重的差异不超过5 mg为止。根据减失的重量，计算供试品中含水量（%）。每种栽培土壤取3批灵芝样本进行检测。

1.2.3.2 浸出物含量检测

取供试品约2~4 g，精密称定，置100~250 ml的锥形瓶中，精密加水50~100 ml，密塞，称定重量，静置1小时后，连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸1小时。放冷后，取下锥形瓶，密塞，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，用干燥滤器滤过，精密量取滤液25 ml，置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3小时，置干燥器中冷却30分钟，迅速精密称定重量。每种栽培土壤取3批灵芝样本进行检测。

2 结果

2.1 不同土壤栽培灵芝子实体的形态比较

取4种土壤栽培的灵芝子实体各3株，进行初步经济性状比较，包括干重、芝面长、芝面宽、柄长、柄粗。结果表明，山核桃壳、山沙土、玉米芯及玉米秸秆栽培的灵芝子实体干重（g）分别为333.33±38.19、286.67±51.32、177.67±38.68及213.33±51.32。与山核桃壳比较，玉米秸秆及玉米芯干重均明显降低（P＜0.05或P＜0.01），山沙土干重有降低趋势（P＞0.05），与山沙土比较，玉米芯干重明显降低（P＜0.05），玉米秸秆干重有降低趋势（P＞0.05），4种土壤栽培的灵芝子实体芝面长、芝面宽、柄长及柄粗均无明显差异（P＞0.05），详见图1。

图1 不同栽培土壤种植灵芝性状a,e：山核桃壳栽培（1号）；b,f：山沙土栽培（2号）；c,g：玉米芯栽培（3号）；d,h：玉米秸秆栽培（4号）Figure 1 Characters of Ganoderma lucidum in different cultivated soils.a,e:Carya cathayensis shell cultivation(No.1);b,f:Mountain sand soil cultivation(No.2);c,g:Corn cob cultivation(No.3);d,h:Corn straw cultivation(No.4)

2.2 不同土壤栽培灵芝中灵芝多糖和三萜及甾醇类成分含量测定

如表1所示，4种土壤栽培的灵芝多糖含量在0.914~1.035%之间，符合药典规定。其中，采用3号和4号土壤栽培的灵芝中多糖含量相对较高，而采用2号土壤栽培的灵芝中此成分含量较低。4种土壤栽培的灵芝三萜及甾醇含量在1.188~1.558%之间，均符合符合药典规定。其中，采用3号和4号土壤栽培的灵芝中三萜及甾醇含量相对较高，而采用1号土壤栽培的灵芝中此成分含量较低。灵芝多糖和三萜及甾醇类成分的含量在4种土壤之间均无明显差别（P＞0.05）。

表1 四种土壤栽培灵芝中灵芝多糖和三萜及甾醇类成分含量测定Table 1 Contents of polysaccharide,triterpenoids and sterols in Ganoderma lucidum cultivated in four soils

2.3 不同土壤栽培灵芝中浸出物比较

如图2所示，4种土壤栽培的灵芝浸出物在4.650~4.934%之间，均符合药典规定。其中，4号土壤栽培的灵芝样本中能够检测到含量较高的浸出物。

图2 四种土壤栽培灵芝中浸出物检查结果Figure 2 Results of extracts in Ganoderma lucidum cultivated in four soils

2.4 不同土壤栽培灵芝中水分含量比较

如图3所示，4种土壤栽培的灵芝水分含量在11.10~12.46%之间，均符合药典规定。其中，4号土壤栽培的灵芝样本中水分含量较少，而3号样本含水量相对较高。

图3 四种土壤栽培灵芝中水分检查结果Figure 3 Results of water examination in Ganoderma lucidum cultivated in four soils

3 讨论

为了探讨不同栽培土壤对灵芝药材质量的影响，本研究采用药典方法对4种栽培土壤种植的灵芝进行初步经济性状比较，并对其三萜及甾醇类成分、多糖类成分以及水分和浸出物含量进行测定与比较。结果表明，4种栽培土壤所种植的灵芝上述各项指标均符合药典要求，提示山核桃壳、玉米芯及玉米秸秆土壤均可代替山沙土培育灵芝。在经济性状比较中，玉米秸秆及玉米芯土壤栽培的灵芝子实体干重明显低于山核桃壳，但主要成分多糖、三萜及甾醇含量确相对较高，可能与其质轻疏松，保水量低有关。

山核桃树是一种野生乔木，山核桃仁约占核桃重量10%，90%是壳。山核桃仁含有丰富的不饱和脂肪酸和丰富的优质蛋白质，被开发出多种高档保健品。由此产生了大量的核桃壳废弃物，污染了环境。山核桃壳是一种由多孔的木质素和纤维素组成的物质，具有较大的比孔容积和比表面积，其保水量达山核桃重量的70%，自然条件下保湿时间长达72小时。用山核桃壳粉代替土壤，不仅能很好供应水分，本身又是有机质，起到肥效作用，优于土壤。玉米是吉林主要的农作物，其产量位居全国第一。秋收后玉米脱粒，玉米棒（玉米芯）堆积如山，除少量供工业用，大量当柴烧。玉米棒外层多由木质素，纤维素组成，棒心多为纤维素，尚含有多种B族维生素和矿物质。粉碎后质轻，吸水较慢，保水量适中，用其代替土壤培育灵芝，不仅可提供水分，还可以提供碳水化合物、维生素、矿物质等灵芝所需的营养素。每年我国农业生产中产生的玉米秸秆约有3.5亿吨。如何变废为宝，高效率低成本地利用玉米秸秆，成为当前在生物质资源利用领域的研发热点。玉米秸秆含有30%以上的碳水化合物、2%~4%的蛋白质和0.5%~1%的脂肪。以山核桃壳粉、玉米芯粉及玉米秸秆粉等有机质取代土壤，不仅可解决土地资源问题，也减少山核桃壳、玉米芯及玉米秸秆的废弃污染，变废为宝。综合考量可优先选择玉米秸秆栽培土壤进行灵芝种植，有待活性研究进一步证实。