保元汤对大鼠肝细胞色素CYP450酶不同亚型的影响

张亚杰，贾旭爽，李丽静，陈宇杨，鲍慧玮

(长春中医药大学·吉林长春·130117)

保元汤是《古代经典名方目录(第一批)》中的一个复方，具有益气温阳功效，主治虚损劳怯，元气不足，现代医学主要用于治疗慢性肾病如慢性肾功能衰竭、慢性肾炎，此外还用于冠心病、乙型肝炎、再生障碍性贫血等疾病的治疗。保元汤由黄芪、人参、肉桂、甘草四味中药组成，保元汤在临床应用过程中可能对肝药酶会产生诱导或抑制作用，就会影响到其他药物的疗效或不良反应，所以本实验采用Cocktail探针药物法，探索保 元 汤 对 肝CYP1A2，CYP2C9，CYP2C19，CYP2D6，CYP2E1酶的诱导或抑制作用，为促进保元汤的临床合理用药提供实验依据。

1 实验材料

1.1 药品与试剂

人参、黄芪、甘草、肉桂饮片均购自吉林省宏检大药房有限公司。茶碱原料药、双氯芬酸钠原料药、奥美拉唑原料药、右美沙芬原料药，氯唑沙宗原料药、普萘洛尔原料药（纯度大于等于98%）、还原型辅酶II均购自上海源叶生物有限公司。BCA蛋白试剂盒(批号:03415，上海天根生化科技)，逆转录酶及QSCR扩增试剂购自TransGen公司。

1.2 仪器设备

台式低温高速离心机(上海飞鸽仪器厂);LC-l0A型高效液相色谱仪、UV检测器、N-2000工作站(日本岛津公司);酶标仪(伯乐生命医学产品(上海)有限公司)。

1.3 动物和分组

由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供成年雄性Wistar大鼠30只，体重为180~220 g，实验动物合格证号SCXK(吉)2020-0002；动物随机分为空白对照组、人参组、黄芪组、甘草组、肉桂组、保元汤组。

2 方法

2.1 药物的制备与配制

2.1.1 供试药品的制备

根据《简明医彀》（明·孙志宏）记载，保元汤中人参5 g，黄芪10 g，甘草2.5 g，肉桂1 g，按比例取适量药材煎煮浓缩至含原生药量2 g/mL。参照《中药药理研究方法学》动物给药量的换算方法，计算大鼠的每日给药量，保元汤组每日给药量为1.9 g/kg，人参组每日给药量为0.5 g/kg、黄芪组每日给药量为1g/kg、甘草组每日给药量为0.3 g/kg、肉桂组每日给药量为0.1 g/kg、空白组给予等量生理盐水，连续灌胃14 d后，处死动物制备肝微粒体。

2.1.2 探针底物及内标溶液的配制

称取适量茶碱、双氯芬酸钠、奥美拉唑、右美沙芬和氯唑沙宗5种探针底物，加入甲醇溶液中摇匀备用,最终溶液中含有茶碱(10μmol/L)、双氯芬酸钠（25 μmol/L）、奥美拉唑（25μmol/L）、右美沙芬（5μmol/L）、氯唑沙宗(50μmol/L)[1]。

称取适量内标物普萘洛尔加入甲醇∶乙睛（1∶1）的混合溶液中，终浓度为100μg/mL。

2.2 肝微粒体制备

取肝组织：处死后的大鼠在冰浴的托盘中剖开腹部，暴露肝脏，结扎肝门静脉，同时剪断下腔静脉，中肝动脉插硅胶管并灌注冰生理盐水进行冲洗，去除肝脏中残留的血液，反复冲洗到肝脏表面呈土黄色。

制备线粒体上清液：在冰浴的环境下，取一块土黄色的肝脏，用剪刀剪碎，加入4倍肝重的0.25 mol/L的冰蔗糖溶液，倒入玻璃匀浆管中，手动研磨至匀浆状，使微粒体均匀分散。研磨后的组织匀浆液放入冷冻离心机，9000 g离心15 min，用移液器取上清液备用，丢弃下层组织;将上清液再放入冷冻离心机，12500 g离心20 min，再用移液器取上清液备用，丢弃下层组织，所得上清液即为去线粒体上清液。

制备肝微粒体混悬液：88 mmol/L的CaCl2溶液0.1 mL中需加入1 mL上清液，按这个比例在上清液中加入CaCl2溶液(CaCl2的终浓度为8 mmol/L),充分混合，放在冰浴的环境中5 min，在冰浴适当进行振摇，最后放入冷冻离心机，27 000 g离心15 min，轻轻取出上清液，离心管中的沉淀就是肝微粒体。

2.3 肝微粒体蛋白含量测定

按试剂盒的说明完成样本蛋白含量测定。

2.4 肝微粒体孵育

用移液器在EP管中加入5种探针的混合液20 μL，自然挥干后，EP管中加入肝微粒体，37℃恒温水浴，预孵育5 min后，用移液枪加入NADPH启动生物转化反应。EP管中孵育体系总体积为200μL，其中肝微粒体总蛋白浓度为0.5 mg/mL、NADPH终浓度为1 mmol/L,CYP特异性探针药物的终浓度依次为茶碱(10 μmol/L)、双氯芬酸钠（25μmol/L）、奥美拉唑（25μmol/L）、右美沙芬（5μmol/L）、氯唑沙宗(50μmol/L)，体积不足用K2HP04/KH2P04缓冲液(0.05 mol/L,pH=7.4)补充。

孵育反应30 min时移液枪注入冰冷的甲醇∶乙睛（1∶1）的混合溶液200μL，其中含有内标盐酸普奈洛尔(100μg/mL)，终止肝药酶对底物的代谢作用，孵育溶液涡旋混匀后，13000 g,4℃冷冻离心机离心10 min，取上清液冷藏备用。按照预先测定的HPLC条件，取上清液测反应后各探针药物的剩余量，并按下式计算各探针底物的代谢消除百分率。探针底物代谢清除率（%）=

2.5 色谱条件

2.5.1 5种探针底物的HPLC条件

色谱柱Agilent TC-C18（4.6 mm×150 mm，5μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0~8 min，10%A；8~10 min，10%→25%A；10~24 min，25%A；24~34 min，25%→70%A；34~37 min，70%→100%A；37~40 min，100%A）[2]；流速1.0 mL/min；柱温35℃；检测波长210 nm。结果显示5种探针药物与内标物峰形良好，分离完全，无杂质峰干扰，内标物质对其他待测峰无干扰，专属性强[3]，结果见图1。

2.5.2 线性关系考察

精密量取各浓度的探针底物溶液于EP管中，氮吹，每个浓度设3份，建立工作曲线[4]。实验结果以各探针底物和内标物的峰面积比值（y）对各探针底物的浓度（x）进行线性回归，得回归方程[5]。

2.5.3 精密度与准确度

选择相同浓度，用空白组大鼠肝药酶配制质量控制样品，制备6份样品[4]，按照样品处理方法处理分析，分别计算各探针底物的精密度和准确度。

2.6 数据处理及统计分析

3 结果

3.1 线性关系考察

由表1可知，5种探针底物在各自浓度范围内呈良好的线性关系（r≥0.999 5）[7]。

表1 大鼠肝微粒体中5种探针底物的回归方程

3.2 精密度与准确度

表2 5种探针底物的精密度与准确度

3.3 保元汤及单药对大鼠肝细胞色素CYP450酶的影响

各组对茶碱、奥美拉唑、右美沙芬、氯唑沙宗、双氯芬酸钠5种探针底物的代谢消除百分率测定结果见表3。与空白对照组比，甘草组、保元汤组增加茶碱代谢百分率（P＜0.0 5），因此，甘草、保元汤对CYP1A2酶活性具有诱导作用；甘草组、黄芪组可显著降低双氯芬酸钠代谢百分率（P＜0.01），保元汤组降低双氯芬酸钠代谢百分率（P＜0.05），但人参组升高了双氯芬酸钠代谢百分率（P＜0.05），因此对甘草、黄芪、保元汤对CYP2C9酶活性具有抑制作用，而人参对CYP2C9酶具有诱导作用。

表3 保元汤及单药对5种底物的消除百分率（%）（±s，n=5）

表3 保元汤及单药对5种底物的消除百分率（%）（±s，n=5）

注：与空白对照组比*P＜0.05,**P＜0.01

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4 讨论

口服给药吸收进入机体后，大部分需要经肝脏特异性酶进行代谢，进行代谢的主要酶系是细胞色素P450酶（CYP450），CYP450由多种同工酶组成，其中CYP1A2、 CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、和CYP3A4这6种酶参与机体90%以上的药物代谢[8]，而CYP450易受药物的影响，被诱导或抑制，被诱导时会将被代谢的药物代谢量增加，从而降低药物的有效浓度，影响药物的作用效果；被抑制时会将被代谢的药物代谢量减少，从而导致药物血药浓度过高，不良反应的发生率增加，CYP450被诱导或抑制给临床用药带来了很多的不确定性，尤其是中药和西药合用的情形，所以通过本实验的结果可知，保元汤对于肝药酶CYP1A2具有有诱导作用，可能与其含有的甘草对CYP1A2的诱导作用有一定的关系，对于需经CYP1A2代谢的药物，如咖啡因、非那西丁、茶碱、氯氮平、丙米嗪、他克林等，在合用时需要增加合用药物的剂量，保证治疗效果；保元汤中的甘草和黄芪都对肝药酶CYP2C9具有显著的抑制作用，而其中的人参对肝药酶CYP2C9具有诱导作用，四味药作为一个复方应用时可能产生了相互作用，降低了甘草和黄芪的显著抑制作用，因此保元汤对肝药酶CYP2C9的也具有抑制作用，对于需经CYP2C9代谢的药物如甲苯磺丁脲、苯妥英钠、罗芬、吩噻嗪类、镇静催眠药烯苯巴比妥、抗肿瘤药环磷酰胺、性激素孕酮、睾丸酮等[9]，保元汤与这些药物合用时注意观察不良反应。