心理应激复合低氧缺水缺食对大鼠血中激素和细胞因子的影响

王丽峰， 王德文，刘亚华，彭瑞云，张军华，李 杨，左红艳，董 霁，徐新萍

Hormones; Cytokines

在地震、泥石流等严重自然灾害所致房屋建筑倒塌，以及人为质量因素导致地下施工(矿道、地铁等)现场塌方时，多会造成人员的掩埋，长时间被困人员不仅会受到低氧、缺水、缺食等的影响，同时因生死未卜，恐惧、焦虑、绝望等心理因素也可能影响其生命体征和生命耐受力。慢性心理应激会引起躯体和精神情绪异常，并可影响机体的神经内分泌系统和免疫系统[1-2]。下丘脑-垂体-肾上腺轴(Hypothalamic-pituitary-adrenal axis, HPA轴)是最常研究的与应激相关的生物学成分，其可对不断变化的环境需求作出反应，包括心理应激。下丘脑轴控制垂体和肾上腺皮质激素的分泌，其中糖皮质激素是HPA轴活动的主要应激反应指标。同时心理应激会降低宿主对各种疾病炎症的适应能力，可能增加疾病风险，并可能通过炎症途径加快疾病进程。研究发现，急性应激可引起免疫细胞计数和功能方面的变化，增加血液中炎症标志物[3-4]。

本研究以大鼠为实验对象，采用常压低氧舱模拟低氧环境，同时缺水缺食，并施加心理应激，测定血气参数和血清电解质以明确大鼠的生命状态，测定HPA轴相关激素血浆促肾上腺皮质激素和醛固酮，血清皮质醇以及血清炎症相关的细胞因子如白细胞介素-1、白细胞介素-6和肿瘤坏死因子-α的改变，以探讨深埋条件下心理应激对机体免疫功能的影响，对于明确心理应激对深埋人员的生命特征和生命耐受力的影响具有重要意义，可为掩埋人员的救治提供重要依据。

1 材料与方法

1.1实验动物与分组 二级雌性Wistar大鼠120只，体质量(250±20)g，随机分为正常对照组、单纯心理应激组、缺水缺食组(简称二缺组)、10%低氧复合缺水缺食组(简称三缺组)、心理应激复合缺水缺食组(简称心理应激复合二缺组)和心理应激复合10%低氧缺水缺食组(简称心理应激复合三缺组)，每组20只(伦理审查编号IACUC of AMMS-13-2015-04)。

1.2动物模型的建立 采用常压低氧舱建立低氧环境，氧浓度设定为10%，同时不给水和鼠粮，以建立10%低氧复合缺水缺食模型。缺水缺食组大鼠置于舱外的实验室内，仅不给予水和鼠粮。心理应激模型采用猫和定时声响两种刺激，以造成心理压力，具体方案为：警报器响5 min后，闹铃再响5 min，之后将猫置于鼠笼上30 min，每天上下午各1次，且每天晚上隔4 h响闹铃1 h；共7 d。

1.3观察指标 动物模型建立成功后1、3、5和7 d，取大鼠动脉血，肝素抗凝，采用血气分析仪检测pH值、氧分压(PO2)、二氧化碳分压(PCO2)、Na+，K+、Ca2+和Cl-；1 d和7 d取大鼠静脉血，分离血浆和血清，采用Sn-695B型免疫计数器检测血浆促肾上腺皮质激素(Adrenocorticotropic hormone, ACTH)血清皮质醇(Cortisol, COR)和醛固酮(Aldosterone, ALD)，白细胞介素-1(Interleukin-1, IL-1)、白细胞介素-6(Interleukin-6, IL-6)和肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α, TNF-α)等指标。

2 结果

2.1血气参数的改变

2.1.1 pH值变化 与正常对照组比较，二缺组、三缺组和单纯心理应激组与正常对照组比较未见明显改变(P>0.05)，心理应激复合二缺组和心理应激复合三缺组在实验5 d时，动脉血pH值降低(P<0.05)。与单纯心理应激组比较，仅心理应激复合三缺组在实验7 d时，动脉血pH值降低(P<0.05)。其余各组间未见显著差异。见图1。

注：与正常对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与二缺组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与三缺组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与单纯心理应激组比较，#P<0.05，##P<0.01；与心理应激复合二缺组比较，■P<0.05，■■P<0.01图1 心理应激复合低氧缺水缺食对大鼠动脉血pH值的影响

2.1.2 PCO2变化 与正常对照组和单纯心理应激组比较，单纯心理应激组、二缺组和心理应激复合二缺组均未见明显改变(P>0.05)，三缺组和心理应激复合三缺组在实验1、3、5、7 d时，动脉血PCO2均降低(P<0.05或P<0.01)。与二缺组比较，心理应激复合三缺组在实验3、5 d时，动脉血PCO2降低(P<0.01)。与心理应激复合二缺组比较，三缺组在实验1、3、5、7 d时，心理应激复合三缺组在实验3、5 d时，动脉血PCO2也降低(P<0.01)。见图2。

注：与正常对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与二缺组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与三缺组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与单纯心理应激组比较，#P<0.05，##P<0.01；与心理应激合并二缺组比较，■P<0.05，■■P<0.01图2 心理应激复合低氧缺水缺食对大鼠动脉血PCO2的影响

2.1.3 PO2的改变 与正常对照组和单纯心理应激组比较，单纯心理应激组、二缺组和心理应激复合二缺组均未见明显改变(P>0.05)，三缺组与心理应激复合三缺组在实验1、3、5、7 d时，动脉血PO2均降低(P<0.01)。与二缺组比较，三缺组和心理应激复合三缺组在实验3、5 d时，动脉血PO2降低(P<0.01)。与心理应激复合二缺组比较，三缺组在实验1、3、5 d时，心理应激复合三缺组在实验3、5 d时，动脉血PO2降低(P<0.01)。见图3。

注：与正常对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与二缺组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与三缺组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与单纯心理应激组比较，#P<0.05，##P<0.01；与心理应激合并二缺组比较，■P<0.05，■■P<0.01图3 心理应激复合低氧缺水缺食对大鼠动脉血PO2的影响

2.2血清电解质的改变

2.2.1 血清Na+的改变 与正常对照组比较，单纯心理应激组在实验5 d时，二缺组在实验5、7 d，三缺组在实验1、5、7 d时，心理应激复合二缺组和心理应激复合三缺组在实验3、5、7 d时，血清Na+浓度均显著增加(P<0.05或P<0.01)。与单纯心理应激组比较，二缺组在实验7 d时，三缺组在实验1、5、7 d时，心理应激复合二缺组在实验3、7 d时，心理应激复合三缺组在实验3、5、7 d时，血清Na+浓度均显著增加(P<0.05或P<0.01)。与二缺组比较，三缺组5 d时，心理应激复合二缺组在实验7 d时，心理应激复合三缺组在实验5、7 d时，血清Na+浓度显著增加(P<0.05或P<0.01)。与三缺组比较，心理应激复合二缺组在实验1、3 d时，心理应激复合三缺组在实验1、3、5、7 d时，血清Na+浓度显著增加(P<0.01)。与心理应激复合二缺组比较，心理应激复合三缺组在实验5 d时，血清Na+浓度显著增加(P<0.01)。见图4。

注：与正常对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与二缺组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与三缺组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与单纯心理应激组比较，#P<0.05，##P<0.01；与心理应激合并二缺组比较，■P<0.05，■■P<0.01图4 心理应激复合低氧缺水缺食对大鼠血清Na+的影响

2.2.2 血清Cl-的改变 正常对照组和单纯心理应激组血清CI-差异无统计学意义(P>0.05)；与正常对照组和单纯心理应激组比较，三缺组在实验1、5、7 d时，心理应激复合二缺组在实验7 d时，心理应激复合三缺组在实验5、7 d时，血清Cl-浓度均显著增加(P<0.01)；与二缺组比较，三缺组在实验1 d时，心理应激复合三缺组在实验7 d时，血清Cl-浓度显著增加(P<0.01)。与三缺组比较，心理应激复合二缺组和心理应激复合三缺组在实验1 d时，血清Cl-浓度显著减少(P<0.01)。与心理应激复合二缺组比较，心理应激复合三缺组在实验5、7 d时，血清Cl-浓度显著增加(P<0.01)。见图5。

注：与正常对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与二缺组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与三缺组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与单纯心理应激组比较，#P<0.05，##P<0.01；与心理应激复合二缺组比较，■P<0.05，■■P<0.01图5 心理应激复合低氧缺水缺食对大鼠血清Cl-的影响

2.2.3 血清K+的改变 与正常对照组和二缺组比较，三缺组在实验1 d时，心理应激复合三缺组在实验3 d时，血清K+浓度降低(P<0.05或P<0.01)；其余各组间差异无统计学意义。见图6。

注：与正常对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与二缺组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与三缺组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与单纯心理应激组比较，#P<0.05，##P<0.01；与心理应激复合二缺组比较，■P<0.05，■■P<0.01图6 心理应激复合低氧缺水缺食对大鼠血清K+的影响

2.2.4 血清Ca2+的改变 与正常对照组比较，单纯心理应激组和心理应激复合三缺组在实验1 d和3 d时，心理应激复合二缺组在实验1 d和7 d时，血清Ca2+浓度显著增加(P<0.05或P<0.01)。与单纯心理应激组比较，二缺组在实验1 d时，血清Ca2+浓度显著减少(P<0.01)。与二缺组比较，心理应激复合二缺组和心理应激复合三缺组在实验1 d时，血清Ca2+浓度显著增加(P<0.01)。与三缺组比较，心理应激复合二缺组在实验7 d时，心理应激复合三缺组在实验1、5 d时，血清Ca2+浓度显著增加(P<0.01)。见图7。

注：与正常对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与二缺组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与三缺组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与单纯心理应激组比较，#P<0.05，##P<0.01；与心理应激复合二缺组比较，■P<0.05，■■P<0.01图7 心理应激复合低氧缺水缺食对大鼠血清Ca2+的影响

2.3激素的改变

2.3.1 血浆ACTH改变 与正常对照组和单纯心理应激组比较，三缺组在实验1 d时，二缺组和心理应激复合三缺组在7 d时，血浆ACTH增加；心理应激复合二缺组在实验1、7 d时，心理应激复合三缺组在实验1 d时，血浆ACTH显著减少(P<0.01)。与二缺组比较，三缺组在实验1 d时，血浆ACTH增加， 7 d时减少；心理应激复合二缺组在实验1、7 d时，血浆ACTH显著减少；心理应激复合三缺组在实验7 d时增加(P<0.01)。与三缺组比较，心理应激复合二缺组在实验1、7 d时，血浆ACTH显著减少；心理应激复合三缺组在实验1 d时减少，7 d时增加(P<0.01)。与心理应激复合二缺组比较，心理应激复合三缺组在实验1、7 d时，血浆ACTH显著增加(P<0.01)。

注：与正常对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与二缺组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与三缺组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与单纯心理应激组比较，#P<0.05，##P<0.01；与心理应激复合二缺组比较，■P<0.05，■■P<0.01图8 心理应激复合低氧缺水缺食对大鼠血浆促肾上腺皮质激素的影响

2.3.2 血清COR改变 与正常对照组比较，单纯心理应激组、二缺组、三缺组、心理应激复合二缺组和心理应激复合三缺组在实验1、7 d时，血清COR均增加(P<0.05或P<0.01)。与单纯心理应激组比较，二缺组在实验1、7 d时，心理应激复合二缺组在实验1 d时，三缺组和心理应激复合三缺组在实验7 d时，血清COR显著增加(P<0.01)。与二缺组比较，心理应激复合二缺组在实验1 d时，心理应激复合三缺组在实验7 d时，血清COR显著增加(P<0.01)。与三缺组比较，心理应激复合二缺组在实验1 d时，心理应激复合三缺组在实验7 d时，血清COR显著增加(P<0.01)。与心理应激复合二缺组比较，心理应激复合三缺组在实验1 d时血清COR减少，7 d时显著增加(P<0.01)。见图9。

注：与正常对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与二缺组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与三缺组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与单纯心理应激组比较，#P<0.05，##P<0.01；与心理应激复合二缺组比较，■P<0.05，■■P<0.01图9 心理应激复合低氧缺水缺食对大鼠血清皮质醇的影响

2.3.3 血浆ALD的改变 与正常对照组比较，二缺组在实验7 d时，心理应激复合二缺组和心理应激复合三缺组在实验1 d和7 d时，血浆ALD均增加(P<0.05或P<0.01)。与单纯心理应激组比较，二缺组和心理应激复合二缺组在实验7 d时，血浆ALD增加(P<0.05或P<0.01)。与二缺组比较，心理应激复合二缺组和心理应激复合三缺组在实验1 d时，血浆ALD显著增加；心理应激复合三缺组在实验7 d时血浆ALD减少(P<0.01)。与三缺组比较，心理应激复合二缺组和心理应激复合三缺组在实验1 d时，血浆ALD显著增加(P<0.01)。见图10。

注：与正常对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与二缺组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与三缺组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与单纯心理应激组比较，#P<0.05，##P<0.01；与心理应激复合二缺组比较，■P<0.05，■■P<0.01图10 心理应激复合低氧缺水缺食对大鼠血浆醛固酮的影响

2.4细胞因子的改变

2.4.1 血清IL-1的改变 与正常对照组和单纯心理应激组比较，二缺组和三缺组在实验1 d时，血清IL-1减少；心理应激复合三缺组在实验1 d和7 d时，血清IL-1显著增加(P<0.05或P<0.01)。与二缺组和三缺组比较，心理应激复合二缺组在实验1 d时，心理应激复合三缺组在实验1 d和7 d时，血清IL-1显著增加(P<0.01)。与心理应激复合二缺组比较，心理应激复合三缺组在实验1 d时，血清IL-1显著增加(P<0.01)。见图11。

注：与正常对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与二缺组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与三缺组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与单纯心理应激组比较，#P<0.05，##P<0.01；与心理应激复合二缺组比较，■P<0.05，■■P<0.01图11 心理应激复合低氧缺水缺食对大鼠IL-1的影响

2.4.2 血清IL-6的改变 与正常对照组比较，单纯心理应激组、三缺组、心理应激复合二缺组和心理应激复合三缺组在实验1 d时，二缺组在实验1 d和7 d时，血清IL-6均显著减少(P<0.01)。与单纯心理应激组比较，二缺组在实验1 d和7 d时，心理应激复合二缺组和心理应激复合三缺组在实验1 d时，血清IL-6显著减少(P<0.01)。与二缺组比较，三缺组和心理应激复合三缺组在实验1 d时，血清IL-6显著减少；心理应激复合二缺组在实验7 d时，血清IL-6显著增加(P<0.01)。与三缺组比较，心理应激复合二缺组和心理应激复合三缺组在实验1 d时，血清IL-6显著减少(P<0.01)。与心理应激复合二缺组比较，心理应激复合三缺组在实验1 d时，血清IL-6显著减少(P<0.01)。见图12。

注：与正常对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与二缺组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与三缺组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与单纯心理应激组比较，#P<0.05，##P<0.01；与心理应激复合二缺组比较，■P<0.05，■■P<0.01图12 心理应激复合低氧缺水缺食对大鼠IL-6的影响

2.4.3 血清TNF-α的改变 与正常对照组比较，单纯心理应激组、二缺组、心理应激复合二缺组和心理应激复合三缺组在实验1 d时，血清TNF-α明显减少(P<0.05或P<0.01)；单纯心理应激组和二缺组在实验7 d时，血清TNF-α却明显增加(P<0.05或P<0.01)。见图13。

注：与正常对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与二缺组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与三缺组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与单纯心理应激组比较，#P<0.05，##P<0.01；与心理应激复合二缺组比较，■P<0.05，■■P<0.01图13 心理应激复合低氧缺水缺食对大鼠肿瘤坏死因子-α的影响

3 讨论

灾害性事故等引起建筑或地面坍塌，会导致人员被掩埋，这些人员在等待救援过程中，存在着恐惧、惊慌、绝望等多种心理应激情境。已有研究表明，长期慢性心理应激会诱导HPA轴和交感神经系统的持续激活，进而引起级联反应，影响机体的神经内分泌功能和免疫功能，导致肠道菌群失调、诱发炎症反应等[5]。目前灾害性突发事件心理应激的相关研究主要集中在灾后心理危害评估和干预治疗等方面，但关于心理应激对于掩埋人员状态的影响报道较少。

以往研究心理应激模型多采用交流箱，通过足部电击来模拟恐惧心理应激[6]，也有研究通过模拟震动复制地震场景[7]。本研究通过在低氧舱中缺水缺食模拟掩埋状态，在其基础上，采用定时声音和猫两种刺激形式干扰动物睡眠和惊吓来建立心理应激模型。我们前期研究发现心理应激可加重低氧缺水缺食所致的心肾功能损害和血象异常[8]，血清电解质和血氧水平的改变可以反映机体的功能状态，为医学救治提供依据[9]。本实验结果表明，低氧在缺水缺食和心理应激条件下均可降低动脉血PCO2和PO2，心理应激和缺水缺食既未引起上述改变，也未加重其改变；缺水缺食和低氧复合缺水缺食均可引起大鼠血清Na+、Cl-浓度增加，而心理应激对其影响并不显著；低氧复合缺水缺食还可引起大鼠血清K+浓度增加，而心理应激和缺水缺食对其影响并不显著；心理应激和心理应激复合低氧可引起大鼠静脉血Ca2+浓度增加，而缺水缺食和低氧复合缺水缺食对其影响并不显著。提示10%低氧引起大鼠轻度缺氧，缺水缺食可致电解质的紊乱，心理应激不会加重上述改变；心理应激对血清Ca2+的影响，可能与Ca2+作为机体的信号传递的第二信使有关[10-11]。

在各种应激条件下，机体主要通过神经-内分泌-免疫网络而引发自身一系列的神经、内分泌、免疫和行为等方面的改变[12]。应激时HPA轴被激活促肾上腺皮质激素释放激素和精氨酸加压素释放，从室旁核投射到正中隆起，从下丘脑通过垂体门脉血管前脑垂体，二者通过协同作用于其受体，触发ACTH释放进入体循环。接着，ACTH通过2型黑素皮质受体作用于肾上腺皮质，启动糖皮质激素的合成，糖皮质激素立即以弥散的方式进入体循环。另一方面，促肾上腺皮质激素释放激素和精氨酸加压素以及ACTH的连续释放受到糖皮质激素介导的负反馈系统的调节[13-14]。应激包括躯体应激和心理应激，与神经内分泌关系密切，所以神经内分泌指标的改变可用于判断应激的程度，血中ACTH和COR的水平可作为评价应激程度的指标[15]。本实验中低氧和缺水缺食作为躯体应激因素，合并心理应激因素，综合评价动物模型的应激程度。实验结果表明，心理应激、低氧、缺水缺食均可引起大鼠HPA轴的激活，而心理应激复合缺水缺食以及低氧缺水缺食可引起肾上腺皮质功能亢进、垂体功能抑制，提示单纯躯体应激或单纯心理应激可以激活HPA轴，但心理应激复合躯体应激对垂体功能具有抑制作用。缺水缺食可促进肾上腺皮质分泌血浆ALD增加，以起到保钠保水和排钾的作用。

IL-1、IL-6和TNF-α在机体激活与调节免疫细胞及炎症反应中起重要作用[16]。已有研究表明，在应激条件下，糖皮质激素能抑制淋巴细胞的分裂增殖，并可通过其受体的介导而抑制巨噬细胞分泌细胞因子IL-1、IL-6和TNF-α等，引起机体免疫功能下降[17]。本实验通过检测血清中IL-1、IL-6和TNF-α的水平来评价大鼠的免疫功能，结果表明，实验早期缺水缺食、低氧缺水缺食以及心理应激均可引起大鼠免疫功能下降，这与HPA的激活相关；实验后期细胞因子的增加，可能是机体存在炎症反应所致[18]。心理应激对躯体应激产生的免疫功能下降呈现不同程度的影响，可能与机体对损伤的适应程度相关。

综上，缺水缺食、低氧复合缺水缺食和心理应激均可引起大鼠HPA轴激活，免疫功能降低，心理应激可加重低氧以及缺水缺食条件下的损伤效应。因此在营救被困人员时，对其进行有效的心理干预具有重要意义。