基于网络药理学和分子对接技术研究四逆胃痛颗粒治疗萎缩性胃炎的作用机制

孙尧，王艺璇，张洪铭，徐雅娟，黄青，姜彩霞，解生旭，姜英子※

（1.延边大学药物分析教研室，吉林 延吉 133000；2.长春中医药大学，吉林 长春 130117；3.吉林省中医药科学院吉林省中药药效物质基础重点实验室，吉林 长春 130012）

四逆胃痛颗粒由柴胡、白芍和枳实等9味中药组成，是吉林省中医药科学院第一临床医院的协议方剂。处方已临床应用5年以上，可追踪病历1 000例以上，总有效率达97.6%，但对其治疗慢性萎缩性胃炎（CAG）的作用机制尚未深入探讨。现利用网络药理学及分子对接技术研究四逆胃痛颗粒的作用机制，分析方中重要活性成分及其治疗萎缩性胃炎所作用的靶点及通路，为四逆胃痛颗粒后续的药理研究提供思路。

1 材料与方法

1.1 处方中药材成分靶点收集

通过中药系统药理学数据库和分析平台TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php）对四逆胃痛颗粒方中的柴胡、白芍、枳实、三棱、莪术、木香、黄芪、白花蛇舌草和甘草分别进行活性成分靶点的收集，并通过限制口服生物利用度OB≥30%、类药性DL≥0.18对所得的靶点进行筛选，以保证获得靶点的有效性；利用Cytoscape 3.8.0软件绘制四逆胃痛颗粒“中药 成分 靶点”的网络图。

1.2 萎缩性胃炎疾病靶点的收集

利用Genecards（https://www.genecards.org/）数据库，以“atrophic gastritis”为关键词搜索获得疾病的靶点，将获得的靶点与获得的药材靶点利用在线作图平台Venn（http://www.ehbio.com/test/venn/#/）绘图，筛选出活性成分的作用靶点与萎缩性胃炎疾病靶点的交集。

1.3 PPI网络的构建

将1.2作用靶点导入String数据库平台（https://string-db.org/），Organism设置为“Homo sapiens”，构建PPI网络，用Cytoscape 3.8.0软件构建PPI网络。

1.4 核心靶点和关键活性成分的筛选

将1.3获得网络利用Network Analyer功能进行分析，以Betweenness Centrality和Degree两个参数同时大于中位数作为条件筛选出四逆胃痛颗粒的核心靶点，将核心靶点映射到活性成分上，得到关键活性成分。利用Cytoscape 3.8.0软件构建“核心靶点 关键活性成分”网络。

1.5 功能富集分析

利用DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）数据库，限定物种为“homo sapiens”，对1.4中得到的核心靶点进行GO生物功能富集分析和KEGG富集分析，得到的数据利用R语言进行可视化。

1.6 分子对接

利用MGL tools 1.5.6软件将1.3构建的PPI网络中度值排名前3的PTGS2、MAK1、AKT1与构建的“中药 成分 靶点”中度值前两名的槲皮素、山柰酚进行对接。

2 结果

2.1 处方中活性成分的收集和“中药 活性成分 靶点”网络的构建

通过数据库检索，共得到134个活性成分，其中柴胡13个，枳实17个，白芍9个，三棱4个，莪术有1个，黄芪18个，木香5个，白花蛇舌草5个，甘草91个，重复活性成分13个。利用Cytoscape 3.8.0构建“中药 活性成分 靶点”网络，见图1。

图1 “中药 活性成分 靶点”网络Fig.1 "Traditional Chinese Medicine active ingredients target"network

2.2 Venn图的绘制

将活性成分靶点142个与疾病靶点594个，利用在线作图平台Venn（http://www.ehbio.com/test/venn/#/）绘图，获得交集靶点90个，如图2。

图2 四逆胃痛中药材的成分靶点与慢性萎缩性胃炎相关靶点的韦恩图Fig.2 Venn diagram of component targets of Sini Weitong Traditional Chinese Medicine and related targets of chronic atrophic gastritis

2.3 PPI网络的构建

数据库分析的90个交集靶点，绘制四逆胃痛颗粒的PPI网络，见图3。越靠近中心的靶点相互关联的作用越强，degree值排名前3的分别为AKT1（namely Protein Kinase B）、TP53（Tumor Protein P53）、IL6（Interleukin 6），将这些靶点作为四逆胃痛颗粒治疗萎缩性胃炎重要的潜在靶点。

图3 四逆胃痛颗粒的PPI网络图Fig.3 PPI network diagram of Sini Weitong granule

2.4 核心靶点和关键活性成分的分析

筛选得到四逆胃痛颗粒的21个核心靶点，将核心靶点映射到活性成分上，得到86个关键活性成分，排名靠前的有槲皮素、山柰酚、甘草查尔酮甲和柚皮素等。结果见图4。

2.5 GO生物功能及KEGG通路富集分析

将筛选出的21个核心靶点利用DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）数据库，限定物种为“homo sapiens”，进行GO生物功能富集分析和KEGG富集分析，得到了221条GO-BP，16条GO-CC，26条GOMF及100条KEGG通路。分别绘制了GO生物功能及KEGG通路的气泡图，见图5、图6和图7。

图6 GO富集分析柱状图Fig.6 Go enrichment analysis histogram

图7 KEGG通路富集分析Fig.7 The KEGG pathway enrichment analysis

2.6 分子对接验证

选取2.4网络中排名前3的靶点PTGS2、MAK1和AKT1，分别与“核心靶点 关键活性成分”网络中degree值最大的活性成分槲皮素、山柰酚进行对接，结果见图8和表1所示。一般认为结合能小于0时化合物与蛋白可自发结合，结合能＜﹣17.79 kJ/mol时认为配体和受体有一定的结合活性，当结合能＜﹣20.93 kJ/mol时有较好的结合活性，结合能越低，发生作用的可能性越大。结果显示，AKT1与槲皮素，PTGS2、MAK1、AKT1与山柰酚均有一定的结合，其中MAK1、AKT1与山柰酚的结合能均＜﹣20.93 kJ/mol，表明其具有较好的结合性。

图8 分子对接图Fig.8 Molecular docking diagram

表1 关键活性分子与靶点对接表Table 1 Docking of key active molecules and targets

3 讨论

慢性萎缩性胃炎以胃黏膜层慢性炎症为特征，伴有胃腺细胞的丧失，被肠型上皮、幽门型腺体或纤维组织替代[1-3]。中医认为此病的病位虽在胃，但导致患病的根本原因是肝脾功能失调，如肝气横逆，木旺乘土；或肝火亢盛，灼伤胃阴；肝血瘀阻，胃失滋养，均可致胃土壅滞，不通则痛[4]。四逆胃痛颗粒方中柴胡、枳实和白芍共为君药。其中柴胡疏肝解郁，升提中气；配伍枳实通降消滞，加强行气解郁之功；配伍白芍酸甘化阴，柔肝和脾，缓急止痛；三棱、莪术共为臣药，气血双施，活血化瘀，行气止痛，化积消癥力彰；黄芪、木香和白花蛇舌草共为使药，有健脾益气，行气解毒之效；甘草作为佐药，既可泻火安神又能调和药性。

为了进一步研究与探讨四逆胃痛颗粒治疗慢性萎缩性胃炎的药效基础及潜在的生物学机制，本文利用网络药理学技术筛选出药效靶点，并与疾病靶点交集，构建PPI网络，运用基因靶点富集分析及通路预测等手段，得到槲皮素、山柰酚和甘草查尔酮甲等核心活性成分。KIMTW等[5]通过研究发现，槲皮素通过降低胃酸，发挥抗溃疡和胃黏膜保护的作用，进而抑制大鼠反流性食管炎和胃炎。亦有研究发现槲皮素可有效抑制幽门螺旋杆菌，而幽门螺旋杆菌与萎缩性胃炎的发生发展有着密切联系[6]。有实验结果证明，增加甘草查尔酮甲的甘草提取物具有抗氧化、抗炎和抗诱变作用，同时甘草查尔酮甲可抑制Akt、ERK和NF-B等多种信号通路来抑制幽门螺杆菌引起的胃炎或肿瘤发生[7,8]。

PPI分析结果显示，四逆胃痛颗粒可能是通过作用PTGS2、AKT1和MAK1等关键蛋白质靶点来治疗慢性萎缩性胃炎。其中PTGS2是一种诱导酶，通常由炎症因子（Ifs）触发。有研究发现PTGS2蛋白水平随着胃黏膜病变的恶化而逐渐升高，尤其是在感染幽门螺旋杆菌的情况下，在胃癌前病变早期高表达[9-13]。因此，诱导PTGS2可能是胃癌早期发病的关键因素。AKT蛋白在大多数癌症类型中都高度表达，包括HCC、肺癌、乳腺癌以及结肠癌，其中AKT1是治疗癌症的主要药物靶点，在细胞增殖和抗凋亡的过程中发挥作用。与正常黏膜相比，CAG大鼠胃黏膜中AKT1的表达上调，结果提示这些蛋白可能参与了恶性转化[14]。

GO生物富集分析结果显示，四逆胃痛颗粒的21个核心靶点主要作用于促进炎症修复、延缓萎缩性胃炎引起的黏膜萎缩，延缓细胞凋亡有关的细胞增殖、转录、基因表达、趋化因子合成和生物合成调控的生物学过程，以及实现酶结合、蛋白结合等分子功能的过程。

KEGG结果中分析发现四逆胃痛颗粒主要通过调控癌症信号通路（Proteoglycans in cancer、Pathways in cancer、Bladder cancer）、炎症信号通路（TNF signaling pathway、PI3K-Akt signaling pathway）和细胞增殖信号通路（MAPKsignaling pathway）等发挥其抗癌、抗炎和免疫抑制的作用。其中TNF信号通路与四逆胃痛颗粒治疗萎缩性胃炎的15个靶点密切相关，其中IL-6是TNF信号通路的下游靶点。目前已知TNF家族中有约30种生物活性因子，其中主要包括TNF-和TNF-，大量研究表明CAG胃黏膜中TNF-水平较正常显著升高[15,16]，且有学者发现携带TNF-等位基因的萎缩性胃炎患者中患胃癌的风险增加[17]。PI3K/Akt通路能够调控萎缩性胃炎和胃癌胃黏膜的损伤程度，当PI3K激活后，在细胞质膜上产生磷脂酰肌醇三磷酸酯，该蛋白与信号蛋白Akt和磷酸肌醇依赖性激酶1结合，后者在细胞中含有PH结构域，导致Akt激活，从而调节胃黏膜细胞的增殖、分化和凋亡[18]。

综上所述，四逆胃痛颗粒可能通过槲皮素、山柰酚等活性成分，作用于PTGS2、MAK1和AKT1等靶点，并通过调控TNF和PI3K/Akt等信号通路来治疗萎缩性胃炎，这种作用机制体现了中药复方治疗疾病多途径、多靶点的特点，可为探究四逆胃痛颗粒治疗萎缩性胃炎提供理论依据。