早期肝癌无创诊断之匙——循环游离DNA联合型液体活检

叶婷丹， 雷学忠

1 四川大学 华西临床医学院， 成都 610041； 2 四川大学华西医院 感染性疾病中心， 成都 610041

肝癌是全球第四大常见恶性肿瘤。最常用的肝癌标志物主要是AFP、异常凝血酶原 (protein induced by vitamin K absence，PIVKA-Ⅱ)等[1]。目前临床上最常用的肝癌筛查模式——AFP联合超声检测对肝硬化中晚期患者漏诊误诊率高、对小肿瘤的检出率低，以致大部分肝癌患者在被确诊时已处于中晚期，导致严重的经济负担及不良预后。美国肝病学会指南早已不再建议将AFP检测作为单独筛查诊断肝癌的指标。

近年来，随着分子生物学、基因组学等基础学科向癌症领域延伸，液体活检应运而生，已成为肿瘤精准医疗领域的前沿热点。液体活检是指从血液中捕获游离的肿瘤信息，进而反映机体全身肿瘤信息。与传统的穿刺活检相比，液体活检具备无创、可反复采样、可实时“更新反馈”肿瘤负荷、克服肿瘤异质性、指导个性化用药等优点[2]。尤其是循环游离DNA(circulating free DNA, cfDNA)，在肿瘤的早期筛查、诊断、监测、辅助指导治疗，肿瘤来源定位，肿瘤预后及复发，甚至在器官移植、孕妇非侵入性产前检测等研究方向都有了更加深入的研究进展[3-4]。cfDNA自1948年被首次发现以来，已有不少学者[5-13]对其研究进展进行详细归纳、回顾。本文主要对近年来液体活检法联合各类标志物诊断早期肝癌的国内外研究进展及其在临床应用中的潜力进行综述。

1 液体活检研究概述

液体活检具体内容包括cfDNA检测，循环肿瘤细胞(circulating tumor cell, CTC)检测及外泌体检测。其中，CTC是指存在于血液中的游离肿瘤细胞，在肿瘤的术后动态监测及转移、复发等预后评价方面具有巨大的临床应用价值。外泌体则通过多种机制促进肝癌的发生发展，其与肝癌的早期诊断、耐药性检测、预后评估及治疗密切相关。然而，大多数外泌体的研究尚处于细胞实验及体外取材的早期研究阶段，需进一步实验数据支撑。而cfDNA作为液体活检重点研究对象，1948年被Mandel等[14]首次报道后未引起重视，直到1977年Leon等[15]研究发现cfDNA在肿瘤患者血液中浓度明显增加。经过研究者们数十年的不断验证和深入探索，cfDNA在癌症的诊断、监测、治疗等各个方面的应用逐渐广泛。

目前cfDNA的来源机制尚不完全明确，大多数研究认为其是由肿瘤细胞、体细胞凋亡或坏死后释放入血，cfDNA片段也被证实含有与同源肿瘤组织相同的基因异常改变如点突变、扩增、重排等[16]。cfDNA在健康人外周血浓度平均值约30 ng/mL，而在肿瘤患者中浓度明显升高，血浆中的cfDNA半衰期为1.5～2 h[17]。根据具体检测内容不同，cfDNA液体活检主要包括最初的浓度检测即定量分析，进一步的定性分析如cfDNA完整性评估、cfDNA甲基化、肿瘤特异性DNA、cfDNA点突变、杂合子缺失及微卫星不稳定、新兴的cfDNA片段化模式以及尚处于假设阶段、未来可能涉及到的其他研究方向如血浆中线粒体DNA的分数浓度等。

2 cfDNA单独应用的不足

cfDNA的应用目前面临许多障碍。除了患者血浆中肿瘤来源特异性DNA比例通常很低这一因素需要一定的技术支持外，还有不少亟待解决的问题。首先，临床实践中可获得的血液量是有限的，可用标本的cfDNA通常处于低水平；其次，cfDNA在采血后应尽快处理，以免受到血细胞裂解释放的背景DNA干扰。不同的DNA分离技术和仪器也可能产生cfDNA的显著变化。例如目前观察到的常用亚硫酸氢盐转化等离子体方法可以导致输入DNA的降解以及测序数据偏差；而DNA甲基化谱在性别和种族方面也表现出个体差异及肿瘤异质性，可能影响甲基化对应的检测效果。目前该研究领域仍缺乏全球标准化cfDNA分离方案及检测流程。

Liao等[18]第一次对2015年前已发表的文献进行Meta分析以评估cfDNA在肝癌诊断中的应用，结果表明，cfDNA在早期肝癌诊断中具有一定的潜力，但是单纯cfDNA浓度诊断亚组及单基因甲基化亚组的诊断效能均表现不稳定，不足以反映肿瘤的真实情况。同时，AFP联合cfDNA诊断亚组(共6例)中检测敏感度、特异度等所有结果均有改善。由此提出单独运用cfDNA的定量和定性分析进行肝癌诊断时，其结果有很高的假阳性或假阴性概率，这将限制cfDNA的实际价值。

3 cfDNA联合型液体活检

现有更多研究表示cfDNA适宜多指标联合检测或与其他肝癌诊断标志物进行联合检测，笔者回顾2021年7月前已发表的联合诊断型研究详见附录，包括cfDNA定量及定性分析指标间的相互联合诊断；不同甲基化基因的组合诊断；联合AFP、PIVKA-Ⅱ、血清甲胎蛋白异质体(serum alpha-fetoprotein variants，AFP-L3)、α-L-岩藻糖苷酶(α-L fucosidase，AFU)诊断；甲基化及肿瘤拷贝数差之间的联合[19-42]。其中，cfDNA定量或定性分析(尤其是DNA甲基化、肿瘤特异性突变等)与AFP、PIVKA-Ⅱ的联合检测备受关注。

多项基础研究[43-44]证实，血液中检测出的DNA启动子甲基化与其在肿瘤组织中高度一致，DNA甲基化在联合AFP等蛋白标志物时可提高诊断效能，最早的联合甲基化液体活检可追溯至2011年。2017年，Cohen等[45]研究证实，将基因突变与胰腺癌相关的生物标志物联合检测可以提高经血液诊断早期胰腺癌的敏感性，且不会显著提高假阳性率。其在研究中也阐述了联合型液体活检的两大显著优点：既解决了cfDNA缺乏实体肿瘤定位性的问题，其检测效能又优于任一单一肿瘤标志物。这种方法被证实有很好前景应用于多种实体癌症的早期筛查诊断中[43]。在肝癌领域，蛋白质生物标志物与超敏肿瘤特异性DNA结合的一系列研究成为热门，并不断有研究证实cfDNA在肝癌诊断方面可与AFP或PIVKA形成优势互补。液体活检检测原理及内容完全不同于蛋白标志物，在AFP阴性人群中表现依旧良好。但此类研究往往自肝癌患者血液及肿瘤组织学活检对比中得出，验证队列同样为已确诊的肿瘤患者，大多为横断面或回顾性研究，缺乏进一步大规模临床试验验证。Qu等[24]构建的肝癌联合液体活检诊断模型中不但纳入了年龄、性别等可分析的临床特征，其验证队列为前瞻性研究，并随访至今。该诊断模型加入DNA甲基化调整后，正在笔者中心进行一项乙型肝炎肝硬化患者早期肝癌筛查的前瞻性诊断实验研究，预计纳入500例。

4 讨论与展望

现今临床研究中可尝试用于肝癌诊断的生物标志物越来越多，包括传统经典蛋白标志物、表观遗传标志物(cfDNA、肝癌相关基因、微小RNA、长链非编码RNA等)、新兴糖代谢组学寡糖链组分检测(G-test)等。目前已有研究涉及到三联甚至更多蛋白标志物的联合诊断，例如甲基化基因联合检测面板、异常甲基化基因与微小RNA组合模型[37]、G-test联合AFP及PIVKA-Ⅱ[46]等等，但识别准确可行的标志物及诊断模式仍十分具有挑战性，研究目标应该依旧是不显著降低特异性的前提下尽可能提高检测手段的敏感性。

cfDNA的优势在于相对无创、可重复、可监测，与肿瘤突变具有高度一致性；且检测原理完全不同于蛋白标志物，经研究证实与AFP、PIVKA等无显著相关性，在肝癌诊断中具有叠加效应；对于评估预后、监测复发方面亦有重要作用。不足之处在于cfDNA检测敏感度仍然较低，单独应用稳定性差，不推荐独立应用；其检测大体基于聚合酶链式反应和下一代测序技术(NGS)两大类，尤其是NGS检测依赖于高通量的技术、高质量的血液样本、高额的研究成本，cfDNA的样品处理、DNA提取、定量和数据分析等方面未得到规范统一，使得这些研究结果难以直接比较；此外，已发表的研究样本量普遍偏少，部分研究缺乏与AFP等常用标志物的对比分析，部分研究在选择肝癌患者时仅关注HBV或HCV相关肝癌，其结果缺乏包容性及可重复性。目前研究显示，cfDNA在联合应用中诊断敏感度可提高至70%～80%，特异度80%～90%。cfDNA对肝癌的诊断和/或预后价值的明确结论尚需进一步的多中心、大样本、前瞻性研究。为最大程度发挥cfDNA价值，在今后相关研究设计过程中可考虑建立规范、标准、可重复的cfDNA检测流程及评定标准；选择已被证实的特异性肝癌突变基因、甲基化位点进行互补验证、联合诊断甚至序贯诊断；纳入各种病因、各临床分期肝癌患者分层分析，适当扩大样本量，增加前瞻性研究比例；继续探索验证新发现的潜在标志物如外泌体、游离RNA等。随着以上问题的逐一解决，cfDNA联合型液体活检法必然能够打开“无创”诊断肝癌的快捷之门，使得肝癌诊断水平得到质的飞跃。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：叶婷丹对研究的思路或设计有关键贡献，参与了研究数据的获取分析解释过程，参与起草或修改文章关键内容；雷学忠负责指导撰写文章并最后定稿。

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