雷帕霉素靶蛋白/自噬信号通路在结核性气管支气管狭窄中的作用机制研究

周磊 罗莉 卢志斌 丁衍 肖阳宝

气管支气管结核(tracheobronchial tuberculosis,TBTB)是国内良性气管支气管狭窄的首要病因，管腔疤痕组织形成也是TBTB介入治疗后狭窄回缩的主要原因[1]。TBTB气道内病灶处的成纤维细胞过度增殖、肉芽组织增生、炎症反应增强、胶原纤维合成增多导致管腔反复瘢痕狭窄，甚至瘢痕闭塞，影响患者疗效及预后[2-5]。雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)是细胞生长和增殖的重要调节因子[6]，在被激活的情况下，可促进细胞生长分裂及细胞外基质(如胶原蛋白)的分泌。自噬是细胞自我保护的一种机制，在氧化应激、DNA受损、各种理化因素的影响下自噬活性增强[7]，mTOR可通过抑制自噬的活性发挥调控作用[8]。有研究显示，mTOR/自噬信号通路在结核分枝杆菌感染、纤维化病理生理过程中发挥作用，当结核分枝杆菌感染后，mTOR活性增强，自噬活性被抑制；当mTOR表达抑制，自噬活力恢复，可增强巨噬细胞的杀菌能力[9]。抑制mTOR/自噬信号通路可减少炎症及生长因子如血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子β(TGF-β)等表达[10-11]，减轻炎症反应及瘢痕增生。本研究旨在探讨mTOR/自噬信号通路在结核性气管支气管狭窄中的表达趋势及致纤维化作用，以便深入了解结核性气管支气管狭窄的发病机制，为预防和治疗该疾病提供新思路。

对象和方法

一、 研究对象

收集湖南省胸科医院2020年6月至2021年6月经外科评估需要手术切除病灶的肺曲菌患者，共10例，作为正常对照组，包括男6例，女4例；年龄20～58岁，平均(39.7±11.1)岁。收集同期结核性气管支气管狭窄患者27例；男10例，女17例；年龄23～70岁，平均(45.5±12.0)岁；包括13例结核性增生患者(结核性增生组)，14例结核性瘢痕患者(结核性瘢痕组)。本研究通过湖南省胸科医院伦理委员会批准 (编号：LS2021051805)。

二、纳入和排除标准

1.结核性增生组及结核性瘢痕组的入选标准：根据《WS 288—2017 肺结核诊断标准》确诊活动性肺结核患者；经支气管镜检查和(或)病理学、细菌学检查确诊为气管支气管结核初治患者。结核性增生组在抗结核药物治疗1周后行支气管镜介入治疗，活检钳取病变部位肉芽组织；结核性瘢痕组在抗结核药物治疗过程中患者有气促症状，需要介入治疗的瘢痕狭窄型气管支气管结核，在介入治疗过程中活检钳取瘢痕组织[4]。

2.正常对照组排除标准：排除合并结核病及肿瘤、糖尿病、风湿免疫等其他疾病。

3.结核性增生组及结核性瘢痕组排除标准：排除合并耐药结核分枝杆菌、人类免疫缺陷病毒感染及糖尿病的患者。

三、研究方法

1. 免疫组化：各组气道肉芽、瘢痕组织等予以4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋、切片后，通过免疫组化检测mTOR、自噬相关蛋白3(LC-3)、TGF-β1、胶原蛋白1(COL-1)表达情况，使用光学显微镜拍片后，使用 ImagePro Plus 6.0图像处理软件对免疫组化图片进行分析。

2. 蛋白质印迹法检测mTOR、LC3蛋白表达水平：提取组织蛋白，经蛋白质定量BCA法蛋白定量后上样，聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质，分别切胶mTOR(250-289kD)，LC3(14-18kD)转膜并封闭，将聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)分别与mTOR(1∶5000)、LC3(1∶1000)、β-肌动蛋白(β-actin)(1∶5000)一抗4 ℃孵育过夜，使用1%吐温(TBST)缓冲液洗涤3次后，将膜放入1∶5000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠或山羊抗兔的二抗中，室温孵育1 h，使用增强型化学发光试剂(ECL)显色曝光，并使用Image J 1.5图像处理软件分析目的蛋白和β-actin的平均灰度值，以相关目的蛋白与β-actin灰度值的比值计算目的蛋白的相对表达量。

3. 运用实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测TGF-β1、COL-1 mRNA相对表达量[1]：Trizol试剂提取组织总RNA，琼脂糖凝胶电泳，以组织总mRNA为模板，逆转录cDNA，实时荧光定量PCR检测TGF-β1、COL-1 mRNA的表达。引物序列见表1。

表1 引物序列

4. 主要材料：PCR引物购自上海生工生物工程有限公司；总RNA提取试剂、逆转录试剂盒、实时定量逆转录PCR试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司；鼠抗β-actin单克隆抗体、兔抗mTOR、兔抗LC3均购自武汉三鹰生物技术有限公司；兔抗COL-1、兔抗TGF-β1均购自艾博抗(上海)贸易有限公司；HRP标记的山羊抗鼠、山羊抗兔的二抗均购自武汉三鹰生物技术有限公司。

四、统计学处理

采用SPSS 22.0统计软件对数据进行统计分析。计量资料采用“均数±标准差”表示，对研究数据进行正态性检验，呈正态分布时，多组比较采用完全随机设计方差分析，两两比较采用 LSD-t检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。

结 果

一、各组mTOR、LC3、TGF-β1、COL-1免疫组化检测蛋白表达情况

mTOR、TGF-β1、COL-1蛋白阳性表达量在结核性增生组中均高于结核性瘢痕组，在结核性瘢痕组中均高于正常对照组；LC3表达正好相反，正常对照组高于结核性瘢痕组，结核性瘢痕组高于结核性增生组。见表2。

表2 各组气管支气管组织免疫组化结果

二、各组mTOR、LC3蛋白质印迹法检测蛋白表达水平

mTOR蛋白表达量在结核性增生组高于结核性瘢痕组，结核性瘢痕组高于正常对照组；LC3蛋白表达量正好相反，正常对照组高于结核性瘢痕组，结核性瘢痕组高于结核性增生组。见图1、表3。

图1 各组mTOR、LC3在蛋白质印迹法中的蛋白相对表达量

表3 各组气管支气管组织中相关蛋白相对表达量

三、各组TGF-β1、COL-1 的RT-qPCR检测mRNA的表达水平

TGF-β1、COL-1的mRNA表达量在结核性增生组中均高于结核性瘢痕组，结核性瘢痕组均高于正常对照组(P值均<0.05)。见表4。

表4 各组气管支气管组织中TGF-β1、COL-1 mRNA

讨 论

结核性气管支气管狭窄是良性气道狭窄发病最常见的病因[1-2，12]，除此之外，气管插管、气管切开等也可引发。不同于气管插管、气管切开等主要以机械损伤因素所致，结核性气管支气管狭窄发病是MTB对气管支气管壁持续破坏与机体组织修复导致的病理过程[13-15]，发病机制较为复杂，与炎症及纤维化相关[4-5,16]， MTB侵蚀气道黏膜、黏膜下层等，破坏气道正常的组织结构，引起炎症反应可以促进伤口分泌生长因子及炎症介质引起病变部位肉芽增殖及瘢痕增生，导致结核性瘢痕气道狭窄。

机体感染MTB后，MTB可通过促进机体巨噬细胞mTOR高表达，抑制自噬活性，进而减弱巨噬细胞灭菌能力[15-16]。而自噬增强可以促进巨噬细胞的灭菌作用。Kim等[17]研究显示，异烟肼(INH)或者吡嗪酰胺(PZA)可激活被MTB感染巨噬细胞的自噬。如在肺纤维化、肾纤维化疾病发病过程中[18-19]，成纤维细胞mTOR高表达，自噬活性降低，进而促进成纤维细胞的增殖分化与细胞外基质的形成，导致疾病进展，而mTOR受体抑制剂雷帕霉素可以抑制成纤维细胞mTOR蛋白的高表达，恢复自噬的活性，减缓相关脏器的纤维化[20]。

本研究显示，mTOR的表达在结核性增生组中表达最高，在结核性瘢痕组中次之，在正常对照组中表达最低，而自噬相关指标LC3的表达正好相反，在正常对照组中表达高于结核性瘢痕组，在结核性瘢痕组中表达高于结核性增生组，这与Rubinsztein等[21]和Singh和Subbian[9]研究结果类似。可见，不管是肺结核还是气管支气管结核的发病，可能都涉及mTOR/自噬信号通路的调控，在发病初期MTB毒力强，细菌负荷量大，mTOR高表达，自噬活性被抑制，导致机体抗MTB的能力减弱，因而感染发病。

当患者经过积极地抗结核治疗或者通过自身的免疫功能，MTB毒力和数量已较前明显下降，气管支气管结核的病变部位在愈合过程中可能出现肉芽增殖及瘢痕狭窄，因此，mTOR的表达在结核性增生组中高于结核性瘢痕组及正常对照组，结核性瘢痕组高于正常对照组，自噬相关指标LC3的表达正好相反。mTOR/自噬信号通路可刺激生长因子及胶原蛋白的分泌，促进病变部位纤维化，导致瘢痕增殖，各组TGF-β1、COL-1的表达与mTOR的表达趋势一致，结核性增生组中表达高于结核性瘢痕组及正常对照组，结核性瘢痕组高于正常对照组，与自噬相关指标LC3的表达相反，表明mTOR/自噬信号通路作为上游信号通路在被激活的情况下，可促进下游TGF-β1、COL-1的表达，进而促进肉芽增殖及瘢痕形成，导致气管支气管管腔狭窄。

综上所述，mTOR/自噬信号通路可能参与结核性气管支气管狭窄的发病，其发病可能与MTB感染所致mTOR的表达上调抑制自噬活性相关，在自噬活性被抑制的基础上，调控生长因子TGF-β1的表达及胶原蛋白COL-1的分泌，促进瘢痕增生，最后导致气管支气管病变部位的瘢痕狭窄。

本研究是基于组织标本进行的研究分析，缺乏细胞机制及动物模型的深入研究，有待未来更进一步的研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突