适合离体微景观月季品种的筛选及应用

赵丽达，马 誉，王 圣，韩贝贝，赵 亮，张晓渤，杜 丽

(南阳师范学院 水资源与环境工程学院,河南省月季种质创新与栽培技术工程研究中心，河南 南阳 473061)

月季(RosachinensisJacq.)是蔷薇科蔷薇属植物，原产于中国，其栽培历史悠久，自汉武帝时期就有月季种植的记录[1].其花色瑰丽，花香馥郁，花型优美，可四时开花，具有极高的观赏价值和经济价值，广泛应用于园林造景和环境绿化之中[2-4].河南省南阳市的石桥镇，被国家林业和草原局、中国花卉协会命名为“中国月季之乡”[5].截至2019年，南阳月季企业已有200多家，种植面积近万亩，月季供应量占全国市场的80%以上，出口量占全国市场的60 %以上[6].但是南阳月季以供应绿化苗木为主，产品单一，缺乏高端园艺产品，更缺乏具有独立知识产权的创意产品.多数月季苗木或盆栽有不耐病虫害、有刺易伤人、不易打理等缺陷.在此背景下，试管月季微景观应运而生.试管月季微景观是指以月季为主要造景材料的离体植物微景观.离体植物微景观(Terrarium in vitro)是通过离体培养技术，将具有观赏价值的植物微型化后，在无菌容器中进行造景，配以颜色各异的培养基，构成具有独特观赏价值的微型艺术景观.较之传统微景观，其具有无需浇水施肥、轻便易携、观赏期长等优点[7-8].

试管开花(In vitro flowering)是利用组织培养技术，通过植物生长调节剂调控和环境调控使植物在组培容器内开花的现象[9].试管花的优点有：花期不受季节限制，任何季节都可欣赏特定植物的开花过程[10]；从生长到开花整个过程无需浇水施肥，便于打理；缩短了植物在自然状态下的成花时间[11]等.

本研究选择适宜的地被月季和微型月季品种为研究对象，以具腋芽茎段为外植体，设计不同的消毒时间，筛选出最佳消毒方法，以期获得无菌母株.利用无菌母株，进行快繁体系和微型化的相关探索，并将其与其他无菌植物搭配造景，旨在筛选出适合试管月季微景观的月季品种并建立试管月季微景观的制作流程.

1 材料与方法

1.1 试验材料

培养材料于2019年5月取自南阳市农业科学院田间栽种5年的健康、无病虫害，具有典型品种特性月季的一年生枝条.一共有8个月季品种用于离体培养，其中，微型月季4种：‘紫色时代’‘草裙舞女’‘小丁香’‘红柯斯特’，地被月季4种：‘寒地玫瑰’‘自由黄金’‘红从容’‘皇家巴西诺’.

1.2 试验方法

1.2.1 月季品种的田间筛选

对8个月季品种的田间性状，特别是开花性状进行初步筛选，以月季‘紫色时代’为对照品种，对各个月季品种的株形、叶片大小、皮刺多寡、花朵直径、花色、花量等方面进行对比分析，以筛选适合试管月季微景观的月季品种.

1.2.2 八个月季品种无菌苗的获得、增殖及微型化

因月季‘紫色时代’株型较小、枝叶纤细、花色鲜艳，故选择该品种为主要试材，探究其适宜的消毒方法、增殖配方以及微型化配方，进而推及其他月季品种.其中消毒方法主要探究消毒液处理时长对消毒效果的影响；增殖配方主要探究在MS培养基基础上，不同浓度的6-BA和IBA组合对月季无菌芽的增殖诱导效果；微型化配方主要探讨MS培养基中大量元素及蔗糖用量的减少对月季无菌苗生长的控制效果.

1.2.3 月季试管开花的观测

在对8个月季品种进行增殖的过程中，对出现试管开花现象的月季进行连续性观测，并根据萼片形态、花瓣形态及显色状况对其进行初步的开花阶段划分及最佳观赏期判定.

1.2.4 试管月季微景观的制作

在获得月季无菌苗增殖配方的基础上，对上述8个月季品种进行有效增殖，筛选大小适宜的月季无菌苗；以微型化配方为基础，通过调控食用色素(其颜色包括：宝石蓝、青绿、青柠、辣椒红、丝绒红、深紫)的添加量，创制多彩培养基；在微型化培养基上，探究月季植株大小、株形、叶色和培养基颜色组合搭配的造景效果.

1.3 项目测定

污染率=(污染数/接种总数)×100%；褐化率=(褐化外植体数/接种总数)×100%；萌发率=(萌发的茎段总数/接种总数)×100%；增殖系数=增殖的不定芽数/长出不定芽的外植体数.

1.4 数据分析

采用Excel 2016软件对试验数据进行处理，SPSS 26.0 软件进行方差分析.

2 结果与分析

2.1 月季品种的田间筛选

对8个月季品种田间性状进行比较，其开花性状如图1所示.以月季‘紫色时代’为对照品种，对月季的形态特征进行了整理，结果如表1所示.经田间性状观察，微型月季‘紫色时代’(图1-A)、‘草裙舞女’(图1-B)、‘小丁香’(图1-E)株型紧凑、枝叶纤细、花朵微小，具有植株微型化的天然优势；为丰富造景植物的花色，地被月季‘自由黄金’(图1-C)也被选为微景观造景植物的主要研究对象.但究竟这些微型月季和地被月季品种是否能够应用于试管月季微景观中，还需经离体培养后再做探究.

图1 八个月季品种的田间开花性状注:A. ‘紫色时代’; B. ‘草裙舞女’; C. ‘自由黄金’; D. ‘红柯斯特’; E. ‘小丁香’; F. ‘红从容’; G. ‘寒地玫瑰’; H. ‘皇家巴西诺’

2.2 八个月季品种无菌苗的获得、增殖及微型化

以月季‘紫色时代’为主要试材，探究外植体的消毒时间，确定最佳消毒方法；比较‘紫色时代’在不同的增殖配方中，无菌苗生长状态的差异，确定最适增殖配方；通过减少MS培养基中大量元素及蔗糖的用量来达到微型化的目的，最终建立起月季‘紫色时代’适宜的无菌苗获得、增殖以及微型化方法(图2)，并推及应用到其他月季品种之中.

表1 八个月季品种的田间性状分析(以月季‘紫色时代’为对照品种)

图2 月季‘紫色时代’无菌苗的获得、增殖及微型化注: A. ‘紫色时代’茎段萌发无菌芽; B. 无菌芽的生长; C. 无菌芽的增殖; D. 无菌苗的微型化; E. 无菌苗微型化失败配方; F. 无菌苗试管开花现象; G. 无菌苗花蕾的细节; H. 无菌苗的生根现象

由表2可知，流水冲洗2 h，75%乙醇浸泡40 s，0.1%氯化汞浸泡5 min，无菌水冲洗3次，使‘紫色时代’达到较好的消毒效果，其茎段腋芽亦可及时萌发(图2-A)，萌发率达86.87%.当延长消毒时间，虽外植体污染率可降低为0%，但在一定程度上抑制了茎段腋芽的萌发，并使其褐化率升高.

表2 不同消毒方法对月季‘紫色时代’外植体消毒效果的影响

由表3可知，MS+1.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1IBA+30 g·L-1蔗糖+8 g·L-1琼脂粉，为‘紫色时代’无菌芽的最适增殖配方，此配方可使其迅速增殖(图2-C).相较于对照组(MS培养基)中6.67%的增殖率和1.00的增殖系数，在该配方中，无菌芽增殖率为100%，增殖系数为2.29，且植株平均高度较其他组的高.

由表4可见，月季‘紫色时代’适宜的微型化配方为：MS/4(大量元素含量为MS的1/4)+30 g·L-1蔗糖+8 g·L-1琼脂粉，较之空白对照组(MS+30 g·L-1蔗糖+8 g·L-1琼脂粉)中植株月平均生长量0.68 cm，在此配方中植株月平均生长量为0.17 cm，此时植株生长状况良好、茎段细软、叶片浅绿(图2-D)，此配方可在不影响植株观赏价值的前提下，有效控制月季无菌苗的旺盛生长.当培养基中蔗糖含量减少为7.5 g·L-1时，植株的月平均生长量仅为0.13 cm，但此时植株叶片发黄、死亡较多(图2-E)，由此可见，减少蔗糖用量可控制月季无菌苗的旺盛生长，但过度减少蔗糖用量会导致月季无菌苗的黄化死亡.

表3 不同植物生长调节剂浓度对月季‘紫色时代’增殖效果的影响

表4 不同微型化配方对月季‘紫色时代’无菌苗生长的影响

通过‘紫色时代’建立的消毒方法，在其他7个品种中应用后，均顺利获得无菌苗.月季‘紫色时代’的最适增殖配方，能使其他5个月季品种(‘草裙舞女’‘自由黄金’‘小丁香’‘红从容’‘皇家巴西诺’)的无菌苗获得有效增殖.由于月季‘红科斯特’和‘寒地玫瑰’的外植体对植物生长调节剂较为敏感，在‘紫色时代’的最适增殖配方上容易形成冗余的愈伤组织，在调控植物生长调节剂用量后(MS+0.30 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1IBA)，也获得了较好的增殖诱导效果.最终，8个月季品种全部获得了相应的无菌苗以及较好的增殖效果(图3).

图3 八个月季品种无菌苗的获得及增殖注:A. ‘紫色时代’; B. ‘草裙舞女’; C. ‘自由黄金’; D. ‘红柯斯特’; E. ‘小丁香’; F. ‘红从容’; G. ‘寒地玫瑰’; H. ‘皇家巴西诺’

对8个月季品种无菌苗的植株性状进行比对分析(表5)，结果显示，微型月季‘紫色时代’‘小丁香’离体培养所得的无菌苗与田间性状筛查结果相符，同样呈现植株小巧、枝叶纤细的特点(图3-A，3-E)，具有观赏价值，被列入可用于离体植物造景的品种选择中.同时，在‘紫色时代’无菌苗的培养中观察到了试管开花现象(图2-F，2-G).

2.3 月季试管开花的观测

在对8个月季品种进行增殖的过程中，发现有3个月季品种(‘紫色时代’‘小丁香’和‘寒地玫瑰’)出现了试管开花现象.其中，月季‘小丁香’在其增殖配方上培养2个月左右稳定开花，可以作为试管开花微景观的主要试材.对试管开花的‘小丁香’进行连续性观测(图4).根据萼片形态、花瓣形态及显色状况，对其试管开花过程进行了初步的开花阶段划分(表6)及最佳观赏期的判定.

表5 8个月季品种无菌苗性状分析表(以月季‘紫色时代’为对照品种)

图4 月季‘小丁香’试管开花的阶段划分 注: A. 幼蕾期-小蕾; B. 幼蕾期-大蕾; C. 现蕾期; D. 初花期; E. 盛花期; F. 衰老期

经对月季‘小丁香’试管开花现象的连续观测，将其现蕾期(图4-C)、初花期(图4-D)及盛花期(图4-E)确定为最佳观赏期，最佳观赏期持续时长约为2周(表6).在观察过程中，发现月季‘小丁香’在试管内的花色有别于其田间花色(图1-E)，花色较浅，初步推测此现象是由于光照强度太弱所致.

表6 月季‘小丁香’试管开花的开花阶段划分依据

2.4 试管月季微景观的制作

经过月季品种的筛选，无菌苗的获得、增殖以及微型化配方的筛选，利用已获得的月季无菌苗在多彩培养基上进行植物造景，根据离体月季植株大小、株形、叶色以及培养基的颜色，搭配出不同的试管月季微景观效果，部分产品如图5-A所示.

按照以下流程来制作试管月季微景观：(1)根据产品立意，设计平面图及立面图，平面图包含植物的位置、种类以及数量信息(图5-B)，立面图包含植物的高度和株形信息(图5-C)，确定设计图纸后，1∶1打印出来，备用.(2)按照图纸要求，选取适宜的造景材料，备用.(3)将配好的多彩微型化培养基置于高压蒸汽灭菌锅中，121℃灭菌20 min；将灭菌后的培养基置于超净工作台内，分装到直径3～4 cm，高约7～8 cm的无菌试管中，分装体积为试管体积的1/4～1/3；在超净台上吹风30 min，吹去多余的水汽，待培养基完全冷却凝固后加盖/木塞，备用.(4)在超净工作台内，将平面图放置在培养基的下方；依据平面示意图，用无菌镊子将造景植物接种于设定的位置，并依据立面图显示效果，调整其高度与姿态.(5)试管加盖/木塞并封口，以确保产品无菌，形成试管月季微景观(图5-D，5-E).试管月季微景观流程初步建立(图6).

图5 试管月季微景观产品展示图注: A. 试管月季微景观部分产品展示; B. 产品‘宁静之泊’立面图; C. 产品平面图; D. 产品远景图; E. 产品细节图; F. 拟开发试管开花月季微景观意向图

图6 试管月季微景观的制作流程图注: 消毒处理: 流水冲洗2 h，75%乙醇浸泡40 s，0.1%氯化汞浸泡5 min，无菌水冲洗3次; 配方1：MS+30 g·L-1蔗糖+8 g·L-1琼脂粉; 配方2：MS+1.0 g·L-1 6-BA+0.5 g·L-1 IBA+30 g·L-1蔗糖+ 8 g·L-1琼脂粉; 配方3: MS/4+30 g·L-1蔗糖+8 g·L-1琼脂粉+40～600 mg·L-1食用色素

在实际生产应用中，由于有统一的图纸，因而按照上述流程，不同的生产者亦可生产出效果一致的某一主题的试管月季微景观产品.为进一步提高试管月季微景观的观赏价值与经济价值，未来主要的研发方向是培育稳定的试管开花月季新产品(图5-F).

3 讨论与结论

本研究筛选出了适于进行试管月季微景观制作的月季品种，通过适宜的消毒方法获得了8个月季品种的无菌苗，筛选获得了较为合适的增殖配方，初步探索了植株微型化的配方.最后，选择适宜的植株进行了试管月季微景观的制作，至此，试管月季微景观的制作流程初步形成.通过植物离体培养技术，将具有观赏价值的月季微型植株及配景植物，栽植到无菌容器中形成的试管月季微景观，即无须浇水施肥，又可长时间正常生长，具有广阔的市场前景，此流程图可在企业的批量生产过程中发挥指导性作用.

植物组织培养是指利用植物细胞的全能性，在无菌条件下，将植物体的任何一部分培养在人工配制的培养基上，并给予合适的培养条件，使之发育形成完整植株的实验技术[12].其在花卉领域的应用有离体快繁、脱毒培养、离体保存种质资源、研发植物人工种子、培育花卉新品种、植物发育过程的观察、基因功能的研究[13-14]等.组织培养技术在观赏植物领域应用广泛，目前已有2000多种木本观赏植物运用了快繁技术[15]，但是鲜有将其与微景观结合，形成可产业化生产的潜在组培产品.本研究的试管月季微景观，属于新型组培观赏品，拓宽了组织培养技术在观赏园艺造景范畴中的应用.

现有的关于月季试管开花的报道多着重于探究试管开花的影响因素，未对试管花的开花过程进行开花阶段划分[16-19]，本研究对月季‘小丁香’进行了初步的试管开花阶段划分，可为后续研究者提供参考依据.相较于苔藓微景观生态瓶[20]以及离体植物微景观专用瓶，本研究中使用的微景观试管直径为3～4 cm，高约7～8 cm，具有更加小巧便携的优点.