大豆根际土壤产ACC脱氨酶细菌的分离与鉴定

黄天姿，李同祥*，汤 薇，孙会刚，王继良

（1.徐州工程学院食品与生物工程学院，江苏徐州 221018；2.廊坊农林科学院，河北廊坊 065000）

豆科植物具有十分广阔的应用空间，可将其用作生物饲料、植物肥料和土地覆盖种植物［1］。豆类农作物可生长在世界各地的各种气候带、各种地形和各种土壤中［2］。农耕土壤中，尤其是作物根际土壤，存在着丰富的、生理活动活跃的多种微生物群落。这些微生物可与植物根系相互作用，影响植物的代谢，其中一类可促进植物生长的根际细菌统称为植物根际促生细菌（Plant Growth-Promoting Rhizobacteria，PGPR）［3］。在PGPR 中，部分细菌能够利用其自身产生的1-氨基环丙烷-1-羧基（ACC）脱氨酶，降低宿主植物根系和植物体内的ACC 水平并减少乙烯的产生，进而减弱由乙烯介导的对宿主植物生长的抑制作用，削弱逆境胁迫对宿主植物造成的伤害，促进宿主植物的生长［4］。因此，可以产生ACC 脱氨酶的细菌备受学者关注，并且被认为在干旱、盐碱地、农药污染和重金属污染等逆境胁迫条件下能有效促进宿主植物生长，是具有广泛应用潜力的一类PGPR［5］。

为筛选能产生ACC 脱氨酶活性的大豆根际土壤细菌，通过菌落形态、生理生化、16S rDNA 基因测序，鉴定了分离得到的5 株活性菌株，并测定了5 个菌株的ACC 脱氨酶活性，丰富了大豆根际土壤产ACC 脱氨酶的细菌资源，对进一步研究大豆促生的菌种资源具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

大豆根际土壤（江苏省食品安全生物芯片检测技术工程实验室所属实验田地取样，土质优良，大豆长势较好），保存于实验室。实验用LB、TSB、DF 及ADF 培养基均为市售。

1.2 实验方法

1.2.1 细菌的分离及纯化

精确称取1 g 土壤，无菌水定容至100 mL，混匀备用。大豆土壤液按10 倍梯度稀释至10-8，吸取100 μL 稀释液于LB（TSB）培养基上，涂抹均匀，于37 ℃培养箱中培养；观察菌落形态。将上述菌落形态各不相同的菌株，挑出单菌落，分别划线于LB 培养基中，37 ℃下培养24 h。分别划线并重复操作3 次以上，最终划线出其单菌落菌株，编号后置于-20 ℃冰箱保藏。

1.2.2 ACC 脱氨酶活性菌株的筛选

1）初筛。将分离出的菌株接种于DF、ADF 培养基（以ACC 作为唯一氮源），37 ℃培养24～72 h，观察菌株生长状况。若菌株可以生长，说明成功筛选出可降解ACC 菌株，若没有生长则表明此菌株无ACC 活性。

2）ACC 脱氨酶活性测定。以每分钟ACC 脱氨酶催化ACC 生成1 μmol α-丁酮酸所需的酶量表示ACC 脱氨酶单位酶活［6］。通过Bradford 比色法测定酶蛋白含量。单位酶活力（U）与总蛋白质量（mg）的比值为比活力，表示活性菌株的ACC 脱氨酶活性（U·mg-1）。ACC 脱氨酶活性计算公式如（1）所示。

1.2.3 ACC 脱氨酶活性菌株的鉴定

1）生理生化鉴定。菌株形态和培养特征观察［7］。

2）16S rDNA 鉴定。提取5 株ACC 酶活性菌株总DNA，16S rDNA PCR 扩增，扩增产物经电泳检测后送至生工生物工程有限公司进行测序，构建系统进化树并进行分析。

2 结果与分析

2.1 根际细菌的分离和纯化

通过细菌培养基，筛选出10 株根际细菌，编号H1～H10，菌落形态特征见表1。从表1 可以看出，细菌的形态大小不尽相同，菌落大多呈圆形、乳黄色，有些菌落表面干燥，有些表面圆滑，分布形式密集与疏散的菌落数量大体相当。

表1 根际细菌菌落形态特征

2.2 具有ACC 脱氨酶活性菌株筛选

从大豆根际土壤分离出的10 株细菌中，以ACC作为唯一氮源的DF、ADF 培养基筛选出5 株具有ACC 脱氨酶活性的菌株，菌株形态特征见图1，ACC脱氨酶活性见表2。从表2 数据可知，H9 的ACC 脱氨酶活性最大，H2 的最小，H9 的活性约为H2 的7 倍。

图1 H1、H2、H8、H9、H10 菌落形态

表2 5 株活性菌株的ACC 脱氨酶活性

2.3 活性菌株的鉴定

5 株活性菌株生理生化反应结果如表3 所示，基因组鉴定结果如图3 所示。结合菌落形态、生理生化及16S rDNA 序列测定，确定H1 为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），H2 为苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis），H8 为贝莱斯芽胞杆菌（Bacillus velezensis），H9 为芽孢杆菌属细菌（Bacillussp.），H10 为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

图3 基于16S rDNA 基因序列构建菌株系统进化树

表3 5 株活性菌株生理生化反应

3 结论与讨论

从大豆根际土壤中分离得到10 株根际细菌，从10株菌株中筛选出5 株能以ACC 作为唯一氮源的细菌。通过菌落形态、生理生化及16S rDNA 测序得出H1 为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），H2 为苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis），H8为贝莱斯芽胞杆菌（Bacillus velezensis），H9 为芽孢杆菌属（Bacillussp.），H10 为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）；检测了这5 株细菌的ACC 脱氨酶活力，其中H9 的ACC 脱氨酶活性最大，为0.097 8 U·mg-1，H2 的ACC 脱氨酶活性最小，为0.013 3 U·mg-1。

具有ACC 脱氨酶活性的微生物已被证明能在一定程度上减轻环境胁迫对植物的伤害［8］。赵龙飞等在大豆根瘤中筛选出8 株具有ACC 脱氨酶活性内生细菌，活性最高的菌株（DD132）的酶活为15.712 U·mg-1［9］。和DD132 相比，本实验从大豆根际土壤中分出的5 株ACC 脱氨酶活性菌株活性低很多（活性最大的H9 仅为0.097 8 U·mg-1），可能与菌株的取样环境不同有关（DD132 是从大豆根瘤中筛选，而H9 存在大豆根际土壤中）。