桔梗皂苷D通过介导Pl3K/Akt/mTOR信号通路调节氧化应激改善糖尿病肾病模型大鼠肾损伤

吴 浩，符丽珍，赵 勇，柯维春，庄乙君

（海南医学院第二附属医院东湖分院内科，海南 海口 570105）

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是终末期肾衰竭的主要原因，发病机制错综复杂，发展到晚期难以治愈[1]。世界卫生组织估计，到2040年全球将DN患者上升到6.42亿[2]。DN的特征在于持续性白蛋白尿、肾小球滤过率逐渐下降和血压升高，临床上主要通过控制血压和血糖，以及减少蛋白尿作为DN的标准疗法[3]。目前尚无治疗DN的特效药物，相关药物研发是当前工作重点。

桔梗皂苷D为桔梗科植物桔梗的干燥根，具有抗炎镇痛、抗肿瘤、保肝和调节免疫等药理作用[4-5]。有研究表明，桔梗皂苷D对四氧嘧啶诱导糖尿病模型小鼠具有保护作用[6]，桔梗皂苷D预处理可通过抑制氧化应激和NF-κB P65表达改善顺铂诱导的肾毒性[7]。然而，桔梗皂苷D对DN的影响机制并不清楚。本研究通过采用高脂饮食联合腹腔注射链尿佐菌素的方法制备DN模型大鼠，观察桔梗皂苷D对DN模型大鼠肾组织损伤、炎症反应、氧化应激和磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of Rapamycin，mTOR）信号通路的影响，为DN的临床治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 药物、试剂和主要仪器

桔梗皂苷D（纯度≥97.7%）和盐酸二甲双胍（中国食品药品检定研究院）；链脲佐菌素（streptozocin，STZ）（美国Sigma-Aldrich公司）；尿蛋白定量试剂盒、苏木素-伊红染液、总胆固醇（total cholesterol，TC）测定试剂盒、甘油三酯（triglyceride，TG）测定试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）测定试剂盒和高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）测定试剂盒（北京百奥莱博科技有限公司）；总超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）测定试剂盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）测定试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）测定试剂盒和辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗兔IgG抗体（南京建成生物工程研究所）；山羊抗大鼠PI3K、磷酸化PI3K（phospho-PI3K，p-PI3K）、Akt、p-Akt、mTOR和 p-mTOR 多克隆抗体（英国Abcam公司）。瑞特GM720血糖仪（华广生技股份有限公司）；全自动糖化血红蛋白（glycated hemoglobin，HbA1c）检测分析仪DT480（盛世东唐江苏生物科技有限公司）；U-T6A可见分光光度计（上海屹谱仪器制造有限公司）。

1.2 动物、模型制备和分组

72只雄性SD大鼠（海南药物研究所有限责任公司），体重180～200 g，许可证号SCXK（琼）2020-0007，饲养于SPF级屏障实验室。将大鼠随机分为6组：正常对照组、模型组、模型+桔梗皂苷D 25，50和100 mg·kg-1组及模型+二甲双胍500 mg·kg-1组。参照祁珊珊等[8]方法复制DN大鼠模型，除正常对照组大鼠外，其余大鼠饲喂高脂高糖饲料的同时ip给予STZ 60 mg·kg-1，72 h后检测血糖，以空腹血糖≥16.7 mmol·L-1表明糖尿病模型制备成功。继续喂食高脂高糖饲料，28 d后，以24 h尿蛋白含量＞30 mg视为DN模型造模成功。DN模型大鼠分为模型组，模型+桔梗皂苷D 25，50，100 mg·kg-1[9]及模型+二甲双胍 500 mg·kg-1组[10]（均ig给予），每天1次，连续14 d；正常对照组ig给予同体积生理盐水。

1.3 样本采集

按1.2分组大鼠，最后一次给药后，留取各组大鼠24 h尿液。尾静脉采血，血糖仪检测血糖。使用3%戊巴比妥钠（40 mg·kg-1）麻醉大鼠，腹主动脉取血5 mL，离心收集上清，分装保存于-20℃。采血后，处死各组大鼠，取大鼠肾组织，部分于冰上用小剪刀剪开，按肾组织∶水=1∶9（V/V）的比例置0℃生理盐水中，制成10%肾组织匀浆；部分肾组织采用4%多聚甲醛固定液固定，石蜡包埋切片，-20℃保存。

1.4 糖化血红蛋白水平和尿蛋白含量检测

取1.3中留取的尿液和血清，采用尿蛋白定量试剂盒检测24 h尿蛋白含量，全自动糖化血红蛋白检测分析仪检测血清中糖化血红蛋白。

1.5 HE染色观察肾组织病理损伤

取1.3中制备好的切片，常规脱蜡脱水后行HE染色，并在光学显微镜下观察并拍摄。并参照Paller法[11]对肾小管损伤情况进行半定量评分。Paller评分标准：肾小管明显扩张，细胞扁平计1分；刷状缘损伤计1分，脱落计2分；细胞质空泡计1分；间质水肿计1分；肾小管腔内有脱落的坏死细胞，未形成管型或碎片计1分，形成管型或碎片计2分。

1.6 试剂盒检测血清血脂指标

取1.3中留取的血清标本，根据试剂盒说明书，采用可见分光光度计测定TC，TG，LDL-C和HDL-C水平。

1.7 ELlSA 检测肾组织中的 lL-6，lL-1 β和 TNF- α水平

取1.3中制备的肾组织匀浆，16 099×g离心15 min，收集上清液，按照ELISA试剂盒说明书检测炎症因子IL-6，IL-1β和TNF-α水平。

1.8 试剂盒检测肾组织中SOD和GSH-Px活性及MDA含量

取1.3中制备的肾组织匀浆，根据SOD，MDA和GSH-Px测定试剂盒说明书分别测定肾组织匀浆中SOD，GSH-Px活性和MDA含量。

1.9 Western印迹法检测肾组织中Pl3K，Akt和mTOR蛋白磷酸化水平

取各组大鼠肾组织裂解提取总蛋白，通过BCA试剂盒测定蛋白质含量。提取等量的蛋白质样品100℃变性5 min后用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离并转移至聚偏二氟乙烯膜，在4℃条件下加相应一抗（1∶1000）并孵育过夜，清洗，4℃下加HRP标记山羊抗兔IgG（1∶10 000），孵育2 h，最后加入ECL发光液曝光处理。ImageJ软件统计各条带积分吸光度值，以p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR积分吸光度值比值，表示蛋白磷酸化水平。

1.10 统计学分析

采用GraphPad Prism 5进行统计分析，实验结果数据表示为±s，组间比较采取t-SNK检验，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 桔梗皂苷D对DN模型大鼠血糖、糖化血红蛋白水平和尿蛋白含量的影响

与正常对照组比较，模型组血糖、糖化血红蛋白水平和尿蛋白含量升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，模型+桔梗皂苷D 50和100 mg·kg-1组和模型+二甲双胍组血糖、糖化血红蛋白水平和尿蛋白含量降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

Tab.1 Effect of platycodin D on blood glucose，glycated hemoglobin（HbA1c）and urinary protein in diabetic nephropathy（DN）model rats

2.2 桔梗皂苷D对DN模型大鼠肾组织损伤的影响

正常对照组肾小球结构完整，基质和系膜未见异常变化，肾小管结构完整。模型组大鼠和桔梗皂苷D 25 mg·kg-1组肾组织坏死明显，肾小球萎缩，肾小管上皮细胞大量变性，并可见大量炎症细胞，肾小管损伤评分升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与模型组相比，模型+桔梗皂苷D 50和100 mg·kg-1组及模型+二甲双胍组肾小球基底膜增厚程度明显改善，肾小球系膜基质增生程度明显减轻，肾小管损伤评分较模型组降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）（图1和表2）。

Fig.1 Effect of platycodin D on pathological changes of renal tissue in DN model rats.See Tab.1 for the rat treatment.Arrows show sites of kidney tissue damage.

Tab.2 Effect of platycodin D on renal tubule injury scores in DN model rats

2.3 桔梗皂苷D对DN模型大鼠血清中TC，TG，LDL-C和HDL-C水平的影响

与正常对照组比较，模型组TC，TG和LDL-C水平升高，HDL-C水平降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，模型+桔梗皂苷D 50和100 mg·kg-1组及模型+二甲双胍组TC,TG和LDL-C水平降低，HDL-C水平升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）（表3）。

Tab.3 Effect of platycodin D on levels of total cholesterol（TC），triglyceride（TG），low-density lipoprotein cholesterol（LDL-C）and high-density lipoprotein cholesterol（HDL-C）in serum of DN model rats

2.4 桔梗皂苷D对DN模型大鼠肾组织中TNF- α，lL-6和lL-1 β水平的影响

与正常对照组比较，模型组TNF-α，IL-6和IL-1β水平升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，模型+桔梗皂苷D 50和100 mg·kg-1组及模型+二甲双胍组TNF-α，IL-6和IL-1β水平显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）（表4）。

Tab.4 Effect of platycodin D on levels of tumor necrosis factor- α（TNF- α），interleukin-6（lL-6）and lL-1 β in kidney tissues of DN model rats

2.5 桔梗皂苷D对DN模型大鼠肾组织中MDA含量及SOD和GSH-Px活性的影响

与正常对照组比较，模型组MDA含量升高，SOD和GSH-Px活性降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，模型+桔梗皂苷D 50和100 mg·kg-1组及模型+二甲双胍组MDA含量降低，SOD和GSH-Px活性升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）（表5）。

Tab.5 Effect of platycodin D on malondialdehyde（MDA）content and activities of superoxide dismutase（SOD）and glutathione peroxidase（GSH-Px）in kidney tissues of DN model rats

2.6 桔梗皂苷D对DN模型大鼠肾组织中Pl3K，Akt和mTOR磷酸化水平的影响

Western印迹结果显示（图2），与正常对照组比较，模型组p-PI3K/PI3K，p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR比值显著升高（P＜0.05）。与模型组比较，模型+桔梗皂苷D 50和100 mg·kg-1组及模型+二甲双胍组p-PI3K/PI3K，p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR比值显著降低（P＜0.05），表明PI3K，Akt和mTOR磷酸化水平降低。

Fig.2 Effect of platycodin D on phosphorylation levels of phosphatidylinositol-3-kinase（Pl3K），protein kinase B（Akt）and mammalian target of Rapamycin（mTOR）in kidney tissues of DN model rats.See Tab.1 for the rat treatment.B was the semi-quantatitive result of A.±s，n=12.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with model group.

3 讨论

本研究结果发现，ig桔梗皂苷D后，DN模型大鼠血糖、糖化血红蛋白水平及TC、TG和LDL-C水平降低，HDL-C水平升高，表明桔梗皂苷D可有效改善DN大鼠血脂异常。肾损伤往往伴随着蛋白尿的产生，蛋白尿是DN进展的独立危险因素之一[12]。DN模型大鼠ig给予桔梗皂苷D后，尿蛋白含量降低，肾组织病理损伤明显改善，表明桔梗皂苷D可改善DN大鼠肾功能。

DN作为炎症性疾病，往往存在炎症细胞浸润和炎症因子水平升高[13]。桔梗皂苷D具有良好的抗炎活性，如通过抑制炎症因子IL-6和TNF-α的生成改善胶原性关节炎小鼠的骨和软骨损伤[14]，抑制炎症因子TNF-α，IL-1β和IL-6水平的升高对乙醇诱导小鼠肝损伤模型具有保护作用[15]。本研究结果表明，DN模型大鼠ig给予桔梗皂苷D后，TNF-α，IL-6和IL-1β水平降低，提示桔梗皂苷D可抑制DN大鼠的炎症反应。

越来越多实验研究发现，许多抗氧化应激物质对DN的发展起到了预防、延缓甚至是治疗的作用[16]。MDA是脂质发生过氧化反应的氧化终产物，测定MDA含量可反映机体脂质过氧化的程度。SOD和GSH-Px是体内重要的氧自由基清除剂，其含量越低，表明抗氧化能力越弱，反之则越强。本研究结果发现，DN模型大鼠ig给予桔梗皂苷D后，MDA含量升高，SOD和GSH-Px活性降低，提示桔梗皂苷D抑制氧化应激对DN大鼠模型具有保护作用。

相关研究表明，DN患者肾组织PI3K/Akt/mTOR信号通路被异常激活，自噬受到抑制，从而引起肾系膜细胞增殖、胞外基质积聚，导致肾损伤、肾小球肥大[17]。何康婧等[18]研究发现，雷公藤多苷片可能通过调控PI3K/Akt/mTOR通路改变肾自噬活性状态，对DN模型大鼠肾损伤起保护作用。本研究结果表明，DN模型大鼠ig给予桔梗皂苷D后，p-PI3K/PI3K，p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR比值降低，提示桔梗皂苷D抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路的活化对DN大鼠模型起保护作用。

综上所述，桔梗皂苷D可改善DN模型大鼠肾组织病理损伤，调控血脂异常，抑制炎症因子的释放，抑制氧化应激，可能是通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路的活化实现的。