抗菌肽buforin Ⅱ结构及其抗菌和抗癌活性研究进展

王玉霞，罗禄军，张 赛，黄晓斐，贾广韬，孙同毅，高媛媛

（潍坊医学院1.药学院，2.生命科学与技术学院，山东省蛋白质与多肽药物工程实验室，山东省高校生物药物重点实验室，山东 潍坊 261053）

抗生素的广泛使用甚至滥用导致耐药性菌株种类和数量惊人地增长，已成为全球性公共卫生安全问题[1]。抗菌肽是具有抗菌活性的多肽分子[2]，相比于传统抗生素，不易产生耐药性，作为对抗抗生素耐药细菌的潜在候选药物备受关注。抗菌肽存在于绝大多数生命体中（包括病毒、原核微生物、真核微生物、原生生物、植物、鱼类、昆虫、两栖类、爬行类和哺乳动物等），是生物经过长期进化适应外在生存环境的产物。组蛋白来源的抗菌肽多存在于鱼类等水生生物体内，与组蛋白氨基酸序列高度相似，在不同生命体中拥有较高的保守性[3]，因其优良的抗菌特性成为近几年的研究热点[4]。

抗菌肽buforin是其中一类组蛋白来源的抗菌肽，主要包括buforin Ⅰ，buforin Ⅱ和buforin Ⅱ衍生肽。buforin Ⅰ最早由Park等[5]从亚洲蟾蜍的胃组织中分离得到，是首个被挖掘的buforin家族抗菌肽。组蛋白H2A通过在蛙胃部冗余表达并分泌到胃内腔，经过胃蛋白酶C的切割，形成含有39个氨基酸残基的多肽，即buforin Ⅰ，其具有较强抗菌活性（表1），形成的抗菌层可以防止外来细菌侵袭蛙胃[6]。buforin Ⅱ是buforin Ⅰ在胞内经蛋白酶进一步切割后得到的含21个氨基酸残基的多肽[7]，其抗菌活性较buforin Ⅰ有较大提高，且具有良好的抗癌活性。本文对buforin Ⅱ及其重要衍生肽的结构及其抗菌和抗癌活性的最新研究进展进行综述，为改造现有抗菌肽，开发生物活性、安全性和稳定性更好的潜力分子及其临床应用提供思路。

表1 buforin及其衍生肽的抑菌活性[5，7，9]

1 buforin Ⅱ的结构

buforin Ⅱ的氨基酸序列为TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK，含有5个精氨酸（arginine，Arg）和1个赖氨酸，带6个正电荷。buforin Ⅱ二级结构的分子动力学（molecular dynamics，MD）模拟结果表明，C端由两亲性α螺旋构成，正电荷侧链和疏水侧链分布在螺旋的两面。多肽主链上第11位氨基酸——脯氨酸处的刚性吡咯环打断了α螺旋，形成了一个脯氨酸铰链，在铰链的N端形成了一个额外螺旋区[7]。buforin Ⅱ具有独特的分子结构，从N端到C端依次为“螺旋-脯氨酸铰链-两亲性螺旋”（图1A），此特殊结构使其具有独特的抗菌机制。随着对其结构与功能探索的深入，研究者以buforin Ⅱ为蓝本设计了大量buforin Ⅱ衍生肽，对抗菌肽结构与功能的研究起到了促进作用。

图1 Buforin Ⅱ结构（A）及其选择性穿膜（B）、抗菌（C）、抗癌（D）机制.Arg：精氨酸；Pro：脯氨酸；Lys：赖氨酸.

2 buforin Ⅱ的抗菌作用及其机制

buforin Ⅱ的二级结构与阳离子螺旋抗菌肽，特别是等阳离子螺旋抗菌肽（cathelicidin）家族的LL-37[8]极其相似。LL-37通过利用正电荷的氨基酸残基（Arg/赖氨酸）靶向细菌带负电荷的磷脂和脂多糖，通过扰动细胞膜发挥抗菌作用。但大量研究结果表明，有别于LL-37等阳离子螺旋抗菌肽家族抗菌肽，buforin Ⅱ是穿透细胞膜而非破坏细胞膜发挥作用。因此，研究buforin Ⅱ的穿膜机制有重要意义。

2.1 buforin Ⅱ的穿膜机制

脯氨酸铰链和“Arg面”赋予buforin Ⅱ穿透细胞膜而不破坏细胞膜的特殊生物活性。Uyterhoeven等[9]研究表明，buforin Ⅱ一级氨基酸序列可在水溶液中形成“螺旋-脯氨酸铰链-两亲性螺旋”的二级结构，而其最重要特点是5个Arg处于一个平面，形成一个“Arg面”。这个“Arg面”带有5个正电荷，在遇到负电荷磷脂分子时，通过电荷吸引，分子迅速反转使“Arg面”朝向膜[10]。肽的N端和C端以脯氨酸铰链为核心发生构象转变，与Arg接触的磷脂分子迅速向内部塌陷，形成瞬时孔道进入胞内[11]（图1B）。当11位脯氨酸被置换为其他氨基酸时破坏细胞膜，而非穿透细胞膜，验证了脯氨酸铰链是buforin Ⅱ穿膜而非破膜的关键[7，12]。

与此同时更多的数据表明，富集的Arg是穿膜肽的一个重要特征，许多穿膜肽如Tat，tachyplesin Ⅰ和bactenecin-7等均可通过在序列中富集的Arg发挥穿膜功能[13]。而buforin Ⅱ形成的“Arg面”验证了这一观点，为之后改造多肽和预测多肽结构提供了理论基础。此外，由于buforin Ⅱ可通过独特的穿膜机制将药物递送至胞内而未破坏细胞，在药物递送方面也具有潜在的应用价值[14-16]。

2.2 buforin Ⅱ的抗菌机制

buforin Ⅱ对细菌（G+/G-）和真菌均有广谱高效的抗菌能力（表1）。buforin Ⅱ对几种典型的G+/G-菌均有较强的抑菌活性（最低抑菌浓度≤4 mg·L-1），且对真菌的抑菌活性（最低抑菌浓度为1 mg·L-1）强于细菌。根据buforin Ⅱ穿膜而不破膜的特殊机制，推测其抗菌靶点在胞内。Uyterhoeven等[9]推测其胞内靶点为带负电的DNA，并进行了buforin Ⅱ与DNA体外MD模拟。结果表明，buforin Ⅱ与DNA的双螺旋大沟紧密结合，且结合前后多肽构象并未发生显著改变（图1C）。buforin Ⅱ各氨基酸侧链与DNA结合时的相互作用研究结果表明，Arg2，Arg14和Arg20与DNA的相互作用能较高。借此验证了细菌DNA可能是buforin Ⅱ的抗菌靶点之一。

郝刚课题组[17-18]对buforin Ⅱ及其衍生肽的抗菌机制做了较多研究，主要有以下结果：①buforin Ⅱ可与DNA静电吸附结合，通过消除碱基堆砌力使双螺旋构型解旋达到抗菌效果；②buforin Ⅱ与DNA结合部分较为保守，AT碱基对的浓度越高，结合能力越强；③buforin Ⅱ也可与RNA结合，从而抑制转录和翻译，影响大分子物质合成；④buforin Ⅱ可攻击呼吸链，抑制呼吸作用和ATP合成。

目前，有关buforin Ⅱ抗菌机制方面的研究还停留在体外实验和分子模拟的水平，虽然已经证明buforin Ⅱ可抑制DNA的部分功能，但仍然不排除其他靶点，因此需进一步验证。

3 buforin Ⅱ的结构改造及其衍生肽的抗菌作用

为提高 buforin Ⅱ的抗菌能力，Park等[7]用3种策略对buforin Ⅱ进行结构改造。第1种是截断策略，通过逐一将氨基酸从N端或C端切下，验证截短多肽的抗菌功能。buforin ⅡN端的4个氨基酸残基（TRSS）被切除后，得到衍生肽buforin ⅡA，其序列为RAGLQFPVGRVHRLLRK，抗菌活性得以提升。与之相反，C端氨基酸残基的切除会导致抗菌活性降低（最小抑菌浓度＞256 mg·L-1），且圆二色光谱图显示多肽呈无规卷曲。第2种改造策略是替换策略，在buforin ⅡA的基础上替换个别氨基酸，这一策略同样会导致抗菌活性的丧失。第3种是拼接策略，即用不同多肽片段与buforin核心序列进行拼接。buforin ⅡB是对α螺旋部件（RLLR）进行3次重复得到的buforin Ⅱ衍生物，其序列为RAGLQFPLGRLLRRLLRRLLR。此拼接改造增强了C端两亲螺旋的正电荷密度和疏水强度，其抗菌活性与buforin ⅡA相似甚至更高（表1）。Kim等[19]做了相似的拼接改造，并将之命名为histonin，序列为RAGLQFPVGKLLKKLLKRLKR，与 Bufouin Ⅱ相比其抗菌效果较差（表1），但增强了其在原核表达系统中的表达量。Beyth等[20]在buforin ⅡB的基础上做了进一步改造：一方面通过增强脯氨酸附近氨基酸侧链空间位阻来增强脯氨酸铰链；另一方面将亮氨酸全部替换为疏水性更强的缬氨酸，增强脯氨酸铰链两端两亲性螺旋的疏水强度。改造得到的肽序列为RVVRQWPIGRVVRRVVRRVVR，将其命名为buforin ⅢB。buforin Ⅲ B较buforin ⅡB对大肠杆菌和粪肠球菌有更强的抑制作用。另外，肽环化也可在固定多肽构象的基础上，使抗菌活性得到提升[21]。

此外，增强抗菌肽对蛋白酶的耐受性也是重要的改造方向。Meng等[22]对buforin家族多个抗菌肽进行了氟化改造，通过将亮氨酸侧链甲基的6个氢替换为氟，得到了多个buforin家族抗菌肽的氟化物。这些多肽对胃蛋白酶的耐受显著增强，抗菌能力也得到了保留或加强，但溶血活性却无改变。

4 buforin Ⅱ衍生肽的抗癌作用和机制

buforin Ⅱ抗癌作用的研究起步较晚，由于此时已发现作用机制相同但生物活性更强的buforin ⅡB，为此抗癌作用研究主要集中于buforin ⅡB。

Lee等[23]对buforin ⅡB的广谱抗癌效果进行了验证，对其对人成纤维细胞、小鼠胚胎成纤维细胞、Jurkat和HeLa细胞的细胞毒性进行了检测。结果表明，buforin ⅡB对2种成纤维细胞株（人和小鼠的正常组织细胞）无杀伤作用，但在极低浓度对2种癌细胞的杀伤率即可＞85%。这种对癌细胞的选择性杀伤可能是由于癌细胞膜上有大量带负电荷的神经节苷脂。随后，他们测定了buforin ⅡB对包括非小细胞肺癌、白血病、乳腺癌、中枢神经瘤、黑色素瘤、肾癌、卵巢癌、结肠癌和前列腺癌在内的62种癌细胞株的半数抑制浓度。结果显示，半数抑制浓度均＜25 mg·L-1，表明buforin ⅡB体外有广谱抗癌作用，同时也阐明了buforin ⅡB对癌细胞和正常细胞毒性有差异的原因。癌细胞表面有很多带负电的神经节苷脂，buforin ⅡB带正电荷的“Arg面”可以神经节苷脂为靶点富集到癌细胞表面，从而选择性攻击癌细胞。在选择性进入癌细胞后，内膜系统中只有线粒体表面带有较高密度的负电磷脂，之后则通过线粒体依赖途径来诱导癌细胞凋亡（图1D）。

buforin ⅡB对不同癌细胞的抗癌机制或有不同。Li等[24]报道，buforin ⅡB通过调控周期蛋白依赖性激酶2和周期蛋白A的表达，阻断肺癌细胞HepG 2的细胞周期，从而抑制癌细胞的活性。Han等[25]报道，buforin ⅡB通过P53途径诱导前列腺癌细胞Pc-3和Du-145凋亡。buforin ⅡB在体外的广谱抗癌能力使其成为一种新型的抗癌分子，但由于其对不同癌细胞的抗癌机制不同，因此仍有待深入研究。

表2 组蛋白H2A源抗菌肽buforin Ⅱ的同源肽

5 buforin Ⅱ同源肽与结构改造

buforin Ⅱ为亚洲蟾蜍H2A源抗菌肽，在许多水生生物及两栖动物中均发现了buforin Ⅱ的同源肽（表 2）。其中abhisin[26]来自于盘鲍，当abhisin浓度为250 mg·L-1时，不能抑制其他几种G+/G-致病菌（如溶藻弧菌和副溶血性弧菌）的生长，但对卵形假单胞菌的生长抑制作用强于对其他几种细菌。hipposin[27-28]来自于大西洋比目鱼的皮肤黏液，对多种致病菌均具有良好的抗菌能力。与之类似的还有himantura，litopenaeu和scallop A等。这些抗菌肽均为组蛋白H2A源抗菌肽，序列上保留了脯氨酸铰链，并含有大量带正电荷氨基酸残基。有一个例外是parasin[29]，来自于鲶鱼的皮肤黏液，序列并未保留重要的脯氨酸铰链，且二级结构也与其他组蛋白H2A N端抗菌肽的α螺旋不同，而是以两亲性β折叠为特征。根据序列的保守性，Kong等[4]利用齐河鲫鱼cDNA文库和PCR技术，得到了齐河鲫鱼的组蛋白H2A源抗菌肽Ca-L-hippo，其抑菌效果与hipposin相近。

这些抗菌肽是长期自然选择保留下来的天然肽序列，对其进行活性探究对发现新抗菌肽和改造抗菌肽结构方面意义重大。对不同物种同源片段的整理和分析，既可拓宽研发潜在活性多肽分子的思路，也可加深人们对多肽结构与功能关系的理解，在抗生素滥用导致耐药性严重的今天尤为重要。

5 结语

目前对buforin Ⅱ的研究仍集中于分子改造与作用机制方面，虽可通过各种改造得到抗菌效果良好的衍生肽，但其抗菌作用靶点尚未确定，仍需要继续探索。buforin Ⅱ独特的穿膜机制在纳米药物研究上有独特优势，目前已有研究通过将buforin Ⅱ修饰在磁性纳米粒上，利用其穿膜特性将纳米制剂递送至胞内靶点，但这样的修饰手段抑制了buforin Ⅱ原本的抗菌效力[16，30]。因此，在利用穿膜特性的同时如何保留其原本的抗菌活性也需继续探索。