基于HPLC指纹图谱研究60Co-γ辐射灭菌对烧伤灵酊有效成分的影响

吴 妹，林观昊，黄 妹

（海口市中医医院 药学部，海南 海口 570100）

中药成分复杂多样，微生物含量高，灭菌操作是中药及其制剂生产过程中的关键环节。近年，中药辐照灭菌技术得到广泛应用。60Co-γ辐射灭菌具有可常温灭菌、可对完整包装灭菌、可灵活调整灭菌剂量进行连续灭菌等优势[1-2]，在中药灭菌中应用广泛。

烧伤灵酊是由虎杖、黄柏、冰片三味中药材原粉经加工而成的临床常用外用酊剂，具有清热燥湿、解毒消肿、收敛止痛之功效，临床主要用于I、II度烧伤[3]。方中以具有清热利湿、活血通络功效的虎杖为君药，其主要物质基础为二苯乙烯类（白藜芦醇和虎杖苷）、蒽醌类（大黄素、大黄素甲醚）及黄酮类等[4-5]。臣药黄柏清热燥湿、泻火解毒，盐酸小檗碱为其抗菌的有效成分[6-7]，2020年版《中国药典》将其作为含量测定指标成分。2015年11月国家食品药品监督管理局颁布了《中药辐照灭菌技术指导原则》，规定中药采用辐照灭菌需遵守“安全、有效、稳定”的原则。目前尚无文献报道60Co-γ辐射灭菌对烧伤灵酊中化学成分稳定性有影响。中药指纹图谱技术具有整体性、特征性等特点，能较全面地反映中药复方制剂的物质基础，可更全面客观地评价中药复方制剂的辐照灭菌技术[8-9]。本研究采用高效液相色谱法（HPLC）建立了烧伤灵酊的指纹图谱，确定了共有指纹峰，并对虎杖苷、大黄素、白藜芦醇、大黄素甲醚、盐酸小檗碱5个化学成分进行含量测定。通过比较不同60Co-γ辐照剂量对烧伤灵酊有效成分稳定性的影响，确定合适的60Co-γ辐射灭菌辐照剂量，以期为该药物的质量控制提供依据。

1 仪器和材料

1.1 仪器

Agilent1200高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司），包括在线脱气机，四元梯度泵，自动进样器，VWD-G1314C检测器，Agilent-ChemStation数据处理系统；60Co-γ射线辐照设备（咸阳华科辐照技术有限公司）；AUW-220D型电子天平（d=0.01 mg，日本岛津公司）；KQ-250DB型数控超声波清洗器（昆山超声波仪器有限公司，功率500 W，频率50 kHz）。

1.2 试药与试剂

虎杖苷（批号：111575-201603，含量：87.3 %），大黄素（批号：110756-201913，含量：96.0 %），白藜芦醇（批号：111535-201703，含量：99.4 %），大黄素甲醚（批号：110758-201817，含量：99.2 %），盐酸小檗碱（批号：110713-201814，含量：86.7 %，中国食品药品检定研究院）；胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA，批号：190914），沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA，批号：190328），pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（批号：191026，北京三药科技开发公司）；甲醇、乙腈为色谱纯（德国默克公司）；水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

烧伤灵酊（河北奥星集团药业有限公司，规格：50 ml/瓶，编号：S1～S11，批号：20190111，20190216，20190309，20190426，20190524，20190611，20190906，20190923，20191015，20191118，20191210）。

2 方法与结果

2.1 辐照灭菌

《中药辐照灭菌技术指导原则》（2015年版）规定中药60Co-γ射线辐射灭菌剂量应不大于10 kGy，故本研究分别以 0，3，6，9 kGy剂量辐照处理样品。

2.2 灭菌效果检查

参照《中国药典》2 0 2 0年版四部通则1105“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”进行不同辐照剂量前后样品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数考察。取11批辐照前后烧伤灵酊，制成1:10，1:100，1:1000的待测液，依法测定。需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数测定结果见表1。说明60Co-γ射线辐射灭菌处理后，需氧菌及霉菌和酵母菌总数均大幅度减少，且符合中国药典[10]规定：皮肤给药制剂中需氧菌总数不得超过102cfu/g，霉菌和酵母菌总数不得超过102cfu/g。结果表明60Co-γ射线辐射对烧伤灵酊有很好的微生物杀灭作用。

表1 烧伤灵酊辐照前后含菌量测定结果

2.3 溶液的制备

2.3.1 混合对照品溶液的制备 精密称取虎杖苷、大黄素、白藜芦醇、大黄素甲醚、盐酸小檗碱对照品适量，以甲醇为溶剂配制成虎杖苷、大黄素、白藜芦醇、大黄素甲醚、盐酸小檗碱浓度分别为204.38，351.07，189.85，233.69，92.16 μg/ml的混合对照品溶液，0.45 μm滤膜滤过，备用。

2.3.2 供试品溶液的制备 取烧伤灵酊3瓶，混匀，精密量取5 ml，置100 ml棕色量瓶中，加甲醇-稀盐酸（99:1）溶液80 ml，20 ℃超声处理（功率400 W，频率40 kHz）40 min，取出，再用甲醇-稀盐酸（99:1）溶液定容至100 ml，摇匀，滤过，取续滤液，0.45 μm滤膜滤过，即得。

2.4 色谱条件及系统适用性实验[11-13]

色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.5 %磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～20 min，15 %A；20～25 min，15 %→30 %A；25～35 min，30 %→55 %A；35～50 min，55 %→85 %A；50～60 min，85 %→15 %A）；检测波长：265 nm（20～25 min，盐酸小檗碱），287 nm（0～20 min，虎杖苷；25～60 min，大黄素、白藜芦醇、大黄素甲醚）；流速1.0 ml/min；柱温28 ℃，进样量10 μl。按上述色谱条件测定，结果各色谱峰与相邻色谱峰之间分离度均大于1.5，理论塔板数均大于5500，系统适用性良好。

2.5 烧伤灵酊HPLC指纹图谱研究

2.5.1 稳定性试验 取烧伤灵酊（批号：20190611，辐照剂量：0 kGy），按2.3.2项下方法制备供试品溶液，分别放置0，3，6，9，15，20，24 h，按2.4项下色谱条件进样分析，记录色谱图，并导入“中药指纹图谱相似度评价系统”（2012A版）软件处理，计算7次采集的指纹图谱（以0 h进样的色谱图为参照图谱）相似度，结果各指纹图谱间相似度均大于0.96，表明供试品溶液在室温条件下24 h内稳定。

2.5.2 重复性试验 取烧伤灵酊（批号：20190611，辐照剂量：0 kGy）6份，按2.3.2项下方法处理，按2.4项下色谱条件进样分析，记录色谱图，并导入“中药指纹图谱相似度评价系统”（2012A版）软件处理，计算6次采集的指纹图谱（以第1次进样的色谱图为参照图谱）相似度，结果各指纹图谱间相似度均大于0.95，表明方法重复性良好。

2.5.3 烧伤灵酊指纹图谱的建立 取11批经0，3，6，9 kGy剂量辐照处理的烧伤灵酊供试品适量，按2.3.2项下方法处理，按2.4项下色谱条件进样分析，记录色谱图。分别将不同剂量处理的11批烧伤灵酊色谱图导入“中药指纹图谱相似度评价系统”（2012A版）软件，建立指纹图谱，设置时间窗为0.5 min，采用中位矢量法多点校正，全谱段峰匹配，生成对照图谱。指纹图谱及共有模式见图1。

图1 不同剂量辐照后烧伤灵酊HPLC指纹图谱和混合对照品图谱

2.5.4 指纹图谱共有峰指认及相似度评价 取供试品指纹图谱，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012A版）软件，以未辐照（0 kGy）样品图谱为参照，经多点校正，全谱段峰匹配，生成对照图谱，分别计算11批次样品经不同剂量辐照后指纹图谱与对照图谱的相似度，结果见表2。

表2 相似度计算结果

经0，3，6，9 kGy剂量辐照处理的烧伤灵酊指纹图谱，均可确定22个共有色谱峰，且共有峰总面积占色谱图总峰面积的95 %以上，因此确定这22个色谱峰为烧伤灵酊指纹图谱共有峰，与2.3.1项下对照品比对，确认3号峰为虎杖苷、7号峰为盐酸小檗碱、9号峰为白藜芦醇、14号峰为大黄素、16号峰为大黄素甲醚。

2.6 烧伤灵酊中5个成分定量分析

2.6.1 线性关系考察 分别精密吸取2.3.1项下混合对照品溶液1，2，4，6，8，12 ml，分别置50 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得系列混合对照品溶液。取上述系列混合对照品溶液，按2.4项下色谱条件进样分析，记录色谱图。以质量浓度为横坐标（X，μg/ml），峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，绘制各组分标准曲线，计算相应回归方程和相关系数（r）。结果表明：虎杖苷、大黄素、白藜芦醇、大黄素甲醚、盐酸小檗碱质量浓度与峰面积在试验范围内成良好的线性关系；取混合对照溶液，用甲醇倍比稀释，按2.2项下色谱条件进样分析，分别取峰面积信噪比为10倍（S/N=10）或3倍（S/N=3）时相应对照品浓度为定量限（LOQ）和检测限（LOD）。结果见表3。

表3 5个成分线性回归方程

2.6.2 精密度试验 取2.3.1项下混合对照品溶液，按2.4项下色谱条件连续进样5次，记录色谱图并计算5个成分峰面积RSD值。结果虎杖苷、大黄素、白藜芦醇、大黄素甲醚、盐酸小檗碱峰面积RSD（n=5）分别为0.16 %，0.37 %，0.42 %，0.29 %，0.51 %，表明仪器精密度良好。

2.6.3 稳定性试验 取2.3.2项下烧伤灵酊供试品（批号：20190611，辐照剂量：0 kGy）溶液，分别放置0，3，6，9，15，20，24 h，按2.4项下色谱条件分析，记录色谱图并计算5个成分峰面积RSD值。结果虎杖苷、大黄素、白藜芦醇、大黄素甲醚、盐酸小檗碱峰面积的RSD（n=7）分别为0.78 %，0.69 %，0.75 %，0.89 %和1.01 %，表明供试品溶液在室温条件下24 h内稳定。

2.6.4 重复性试验 取烧伤灵酊供试品（批号：20190611，辐照剂量：0 kGy）6份，按2.3.2项下方法处理，按2.4项下色谱条件进样分析，记录色谱图并计算5个成分含量及相应RSD值。结果虎杖苷、大黄素、白藜芦醇、大黄素甲醚、盐酸小檗碱的含量平均值分别为0.4537，0.5451，0.4115，0.5023，0.2042 mg/ml，RSD（n=6）分别为0.89 %，0.78 %，0.91 %，0.97 %，1.03 %，结果表明方法重复性良好。

2.6.5 加样回收试验 精密量取烧伤灵酊供试品（批号：20190611，辐照剂量：0 kGy）9份，每份2.50 ml，分为3组，每组3份，每组按虎杖苷、大黄素、白藜芦醇、大黄素甲醚、盐酸小檗碱含量的80 %、100 %和120 %精密加入混合对照品，按2.3.2项下方法处理，按2.4项下色谱条件进样分析，记录色谱图并计算各有效成分回收率。结果虎杖苷、大黄素、白藜芦醇、大黄素甲醚、盐酸小檗碱的平均加样回收率分别为100.58 %，100.03 %，99.73 %，99.56 %，99.09 %，RSD分别为0.57 %，0.88 %，0.98 %，0.99 %，0.86 %（n=9），表明本方法回收率良好。结果见表4。

表4 烧伤灵酊中5个成分的加样回收试验结果（n=9）

2.6.6 样品测定 分别取11批经0，3，6，9 kGy剂量辐照处理的烧伤灵酊供试品，按2.3.2项下方法制备供试品溶液，按2.4项下色谱条件进样分析，记录色谱图，计算5个成分含量，结果见表5。

表5 烧伤灵酊5个成分含量测定结果

3 讨论

3.1 色谱条件的优化

本研究采用DAD检测器在190～400 nm扫描烧伤灵酊光谱，结果盐酸小檗碱在265 nm处，虎杖苷、大黄素、白藜芦醇及大黄素甲醚在287 nm处有最大吸收，因此采用287 nm（0～20 min）、265 nm（20～25 min）、287 nm（25～60 min）作为烧伤灵酊指纹图谱分析及5个成分含量测定的检测波长。在流动相选择时，先后考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1 %磷酸、甲醇-0.5 %磷酸、乙腈-0.1 %磷酸和乙腈-0.5 %磷酸6种流动相系统，最后选择乙腈-0.5 %磷酸系统作为流动相，得到的指纹图谱色谱峰数量最多；还对色谱柱Waters XTERRA C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）和Kromasil C18（4.6 mm× 250 mm，5 μm）进行了考察，结果以Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱分离色谱峰基线平稳，分离效果好。

3.2 结果分析

60Co-γ辐照灭菌是利用γ射线直接或间接作用于生物分子，通过破坏和改变生物大分子的结构，从而抑制或杀灭微生物[14]。本文按《中药辐照灭菌技术指导原则》规定，中药最大辐照灭菌剂量不超过10 kGy的原则，选定3，6，9 kGy 3个辐照剂量对烧伤灵酊进行辐照处理，考察60Co-γ辐照灭菌对其指纹图谱及化学成分含量的影响。结果表明，经不同剂量辐照处理后的样品指纹图谱共有峰数量没有变化；经3，6 kGy辐照处理后的样品指纹图谱与对照指纹图谱相似度均大于0.975，而经9 kGy辐照处理后的样品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度平均值仅为0.8223。采用SPSS 22.0软件对5个化学成分的含量进行独立样本t-检验，分析5个化学成分经3，6，9 kGy辐照灭菌后与的含量变化。结果显示辐照剂量为6 kGy及以下时，虎杖苷、大黄素、白藜芦醇、大黄素甲醚、盐酸小檗碱含量变化无统计学意义（P＞0.05）。当辐照剂量达9 kGy时，白藜芦醇和大黄素甲醚的含量较未辐照时分别降低63.36 %和79.65 %，含量变化有统计学意义（P＜0.05）。白藜芦醇含多个羟基和烯键，化学性质不稳定，在γ射线作用下发生异构化降解，部分转化为虎杖苷，导致虎杖苷的含量较未辐照时有所增加[15]；而具有苯甲氧基结构的大黄素甲醚，在γ射线辐照下易发生氢化反应，含量降低[16]。

4 结论

本研究建立的指纹图谱及含量测定方法经方法学验证，可用于分析经不同剂量辐照灭菌后的烧伤灵酊指纹图谱和虎杖苷、大黄素、白藜芦醇、大黄素甲醚、盐酸小檗碱5个化学成分含量测定。研究结果显示烧伤灵酊60Co-γ辐照灭菌剂量不得超过6 kGy，为烧伤灵酊采用60Co-γ辐照灭菌可行性提供理论参考。