HPLC法测定皮肤角质层贴片中3种保湿物质含量

于 梦，孙 玲，张 云，孟祥璟

（山东省药学科学院，山东 济南 250101）

人体皮肤中起保湿作用的物质称为天然保湿因子（NMF）[1-2]，NMF主要由游离氨基酸及其代谢产物（如吡咯烷酮羧酸和尿刊酸）组成[3]。吡咯烷酮羧酸（PCA）是谷氨酰胺的代谢产物[4]，作为一种具有优良吸湿性能的保湿剂大量存在于皮肤角质层中[5]。尿刊酸（UCA）是组氨酸的咪唑丙烯酸衍生物[6]，以反式（trans-UCA）存在于皮肤角质层中，在紫外线作用下会由反式转变成顺式（cis-UCA），从而对皮肤起一定的防护作用[7-8]。在干燥和鳞片状的皮肤中，经常观察到较低水平的吡咯烷酮羧酸和尿刊酸[9]。

国内外关于吡咯烷酮羧酸、尿刊酸测定的文献报道中，前处理过程有的使用大比例水相提取后氮吹浓缩，有的使用加入丙二醇的PBS溶液提取，有的使用碱性溶剂提取后中和，然后采用C18色谱柱进行分离，使用紫外检测器和质谱检测器进行检测[10-17]。已有的方法提取过程繁琐复杂，在C18柱分离时存在吡咯烷酮羧酸与溶剂峰分不开的问题。有人为避免溶剂干扰而使用多波长切换检测，或使用质谱检测器进行检测。本文建立的皮肤贴片的处理检测方法，超声提取后直接进样，使用紫外检测器进行检测，极大简化了样品的前处理过程，解决了同一色谱条件下主成分与溶剂峰、杂质峰分不开等问题。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Angilent1260高效液相色谱仪，配置二极管阵列检测器（美国安捷伦）； AE240万分之一电子分析天平（梅特勒-托利多公司）；XS205DU十万分之一电子分析天平（梅特勒-托利多公司）；Seven Excellence多参数测定仪（梅特勒-托利多公司）；TGL-16gR离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.2 试药

吡咯烷酮羧酸钠（批号：Y05D9S76767，纯度≥98 %），反式尿刊酸（批号：205D9H76812，纯度：98 %），顺式尿刊酸（批号：105D9J76856，纯度≥98 %，上海源叶）；甲醇（色谱纯，天津康科德）；磷酸二氢钾（分析纯，国药集团）；庚烷磺酸钠（色谱纯，山东禹王）；磷酸（色谱纯，天津市科密欧）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Thermo BetaBasic Phenyl（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.02 mol/L磷酸二氢钾溶液（含庚烷磺酸钠5 mmol/L，磷酸调节pH至2.5）（3:97）；检测波长：210 nm；流速：1.0 ml/min；柱温：20 ℃；进样量：20 μl。

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液 取皮肤贴片样品1片，置于2 ml具塞离心管中，胶黏剂一面朝内，加0.02 mol/L磷酸二氢钾溶液（含庚烷磺酸钠5 mmol/L，磷酸调节pH至2.5）1.0 ml，超声30 min，离心，取上清，作为供试品溶液。

2.2.2 对照品溶液 精密称取吡咯烷酮羧酸钠50.47 mg，反式尿刊酸10.21 mg和顺式尿刊酸10.33 mg，分别置10 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为各对照品储备液。分别精密量取各对照品储备液1 ml，置同一100 ml量瓶中，用0.02 mol/L磷酸二氢钾溶液（含庚烷磺酸钠5 mmol/L，磷酸调节pH至2.5）稀释至刻度，配成每1 ml分别含吡咯烷酮羧酸钠、反式尿刊酸和顺式尿刊酸各50.47 μg，10.21 μg，10.33 μg的混合对照品储备液。将混合对照品储备液稀释10倍，即得对照品溶液。

2.2.3 阴性样品溶液 取空白胶带1片，加0.02 mol/L磷酸二氢钾溶液（含庚烷磺酸钠5 mmol/L，磷酸调节pH至2.5）1.0 ml，超声30 min，离心取上清，作为阴性样品溶液。

2.3 专属性

取阴性样品溶液、对照品溶液和供试品溶液各20 μl，按2.1项色谱条件进样分析，记录色谱图，见图1。结果表明，阴性样品溶液在吡咯烷酮羧酸钠、反式尿刊酸和顺式尿刊酸出峰位置无干扰。

图1 专属性试验HPLC图谱

2.4 检测限和定量限

取对照品溶液逐步稀释，至各成分的信噪比S/N接近10作为定量限，至各成分的信噪比S/N接近3作为检测限。结果，吡咯烷酮羧酸钠、反式尿刊酸和顺式尿刊酸的定量限分别为0.1009，0.02042，0.02066 μg/ml，吡咯烷酮羧酸钠、反式尿刊酸和顺式尿刊酸的检测限分别为0.05045，0.01021，0.01033 μg/ml。

2.5 溶液稳定性试验

取同一份对照品溶液，分别在0，1，4，8，12，24 h进样，记录色谱图，观察待测成分峰面积的变化情况。结果吡咯烷酮羧酸钠峰面积的RSD为0.36 %，反式尿刊酸峰面积的RSD为0.48 %，顺式尿刊酸峰面积的RSD为0.64 %，表明对照品溶液在24 h内稳定。

2.6 线性关系考察

取混合对照品储备液，逐级稀释，制成线性供试品溶液。按2.1项色谱条件进样分析，记录峰面积。以峰面积（A）为纵坐标，浓度（C）为横坐标，进行线性回归，分别得回归方程。线性试验结果表明，吡咯烷酮羧酸钠、反式尿刊酸和顺式尿刊酸在相应浓度范围内与其峰面积呈良好的线性关系，结果见表1。

表1 回归方程与线性范围

2.7 精密度试验

2.7.1 重复性 取空白胶带6张，分别加入混合对照品储备液0.1 ml并晾干，按2.2.1项下方法制备6份供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样分析，记录色谱图，外标法计算各待测成分含量，并计算RSD。结果显示，吡咯烷酮羧酸钠含量的RSD为1.01 %，反式尿刊酸含量的RSD为0.69 %，顺式尿刊酸含量的RSD为0.93 %，表明方法重复性良好。

2.7.2 中间精密度 为考察随机变动因素对精密度的影响，在不同日期由不同人员另取空白胶带6张，分别加入混合对照品储备液0.1 ml并晾干，按2.2.1项下方法制备6份供试品溶液，在不同高效液相色谱仪上按2.1项下色谱条件进样分析，记录色谱图，外标法计算各待测成分含量。本试验结果与重复性结果共计12份样品中吡咯烷酮羧酸钠含量的RSD为0.98 %，反式尿刊酸含量的RSD为0.86 %，顺式尿刊酸含量的RSD为1.14 %。由结果可知，方法中间精密度良好。

2.8 加样回收试验

取空白胶带3张，分别加入混合对照品储备液（吡咯烷酮羧酸钠、反式尿刊酸和顺式尿刊酸浓度分别为50.48，10.24，10.22 μg/ml）0.1 ml并晾干，按2.2.1项下方法制备3份供试品溶液，作为100 %水平供试品，同法制备50 %和150 %水平供试品各3份，按2.1项下色谱条件进样分析，记录色谱图，计算待测成分的回收率。测得吡咯烷酮羧酸钠、反式尿刊酸和顺式尿刊酸的回收率分别为92.67 %，98.49 %，98.95 %，RSD分别为2.61 %，1.16 %，0.67 %，表明该方法的准确度良好，结果见表2。

表2 加样回收试验结果（n=9）

2.9 耐用性试验

取空白胶带1张，加入混合对照品储备液0.1 ml并晾干，按2.2.1项下方法制备供试品溶液，作为耐用性样品溶液。分别改变色谱条件中盐的pH值、离子对试剂浓度、有机相比例、柱温、检测波长及流速，取耐用性样品溶液和对照品溶液进样，记录峰面积，外标法计算含量。结果各峰之间分离度均大于1.5，含量的RSD小于2 %，表明本方法的耐用性良好。具体结果见表3。

表3 耐用性试验结果

2.10 样品测定

取10批样品，按2.2.1项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进行测定，记录色谱图，按外标法计算供试品溶液中3种待测成分的含量。样品测定结果见表4。

表4 样品测定结果

3 讨论

3.1 色谱柱的选择

目前分离吡咯烷酮羧酸钠和尿刊酸的色谱柱主要为C18柱[10-17]，实验考察了Agilent ZOBAX SBC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters Xbridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Shim-Pack VP-ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters XTerra C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱对目标物的分离情况。通过减少有机相比例、调整pH值及加入离子对试剂等方式进行试验，结果均显示吡咯烷酮羧酸钠与溶剂峰无法分离。经分析，吡咯烷酮羧酸钠的结构中存在较大共轭体系，在苯基柱上可能有较好选择性，因此改用苯基柱进行试验。通过试验发现，吡咯烷酮羧酸钠在Thermo苯基柱上保留较好，与溶剂峰可实现较好分离，因此本文选择Thermo BetaBasic Phenyl（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱进行实验。

3.2 流动相的选择

为增加吡咯烷酮羧酸钠的保留，选择甲醇-磷酸二氢钾缓冲盐体系进行试验，但效果并不理想。后加入离子对试剂庚烷磺酸钠，通过调整流动相比例及离子对试剂的浓度，吡咯烷酮羧酸钠可与溶剂峰实现完全分离，但峰形较差，且样品中吡咯烷酮羧酸钠峰会与部分杂峰重叠。后续研究发现，降低pH值可显著改善峰形并适当延长保留时间，从而使吡咯烷酮羧酸钠能与溶剂峰和样品中的杂峰实现较好分离。因此，实验最终选择甲醇-0.02 mol/L磷酸二氢钾溶液（含庚烷磺酸钠5 mmol/L，磷酸调节pH至2.5）（3:97）为流动相，此条件下目标分析物分离度好，基线平稳。

3.3 提取溶剂的选择

为了简化提取过程，尽量减少中和、浓缩等提取过程，考察了不同提取溶剂对皮肤贴片中的吡咯烷酮羧酸钠、反式尿刊酸和顺式尿刊酸提取后离心直接进样的效果。以加入一定量的吡咯烷酮羧酸钠、反式尿刊酸和顺式尿刊酸的空白皮肤贴片作为样品，分别用甲醇、不同体积比的甲醇-水溶液和0.02 mol/L磷酸二氢钾溶液（含庚烷磺酸钠5 mmol/L，磷酸调节pH至2.5）对其进行相同时间的超声提取。结果表明，使用甲醇进行提取时吡咯烷酮羧酸钠提取回收率较低，使用不同体积比的甲醇-水溶液进行提取时反式尿刊酸和顺式尿刊酸峰形较差，分别分裂为两个峰。使用0.02 mol/L磷酸二氢钾溶液（含庚烷磺酸钠5 mmol/L，磷酸调节pH至2.5）作为提取溶剂时，吡咯烷酮羧酸钠、反式尿刊酸和顺式尿刊酸都能很好的分散在提取溶剂中，且目标峰的峰形较好，提取回收率在90 %以上。

本文建立了皮肤角质层贴片中吡咯烷酮羧酸、反式尿刊酸和顺式尿刊酸含量测定的HPLC方法。结果表明，该方法样品处理过程简便，可操作性强，可实现同一色谱条件下吡咯烷酮羧酸、反式尿刊酸、顺式尿刊酸与溶剂峰及其他皮肤成分色谱峰的较好分离，灵敏度高，重复性好，可用于皮肤角质层贴片中吡咯烷酮羧酸、反式尿刊酸和顺式尿刊酸的准确测定。