养殖水产品中氯霉素残留量的测定

张倩玉，王磊，于盟盟，梁娟

（日照市海洋与渔业研究院，山东 日照 276826）

氯霉素是一种高效广谱的抗生素，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有较好的抑制作用，曾被广泛用于水产养殖行业。但氯霉素对人体有较强的毒副作用，长期食用氯霉素残留量超标的水产品，可引起人肝脏和骨髓造血机能的损害，导致再生障碍性贫血和血小板减少、肝损伤等病症。此外，氯霉素还会引起肠道菌群失调，导致消化机能紊乱。欧美等发达国家及中国先后颁布了禁止在动物源性食品中使用此类药物的禁令。

目前，氯霉素残留量的检测方法主要有：气相色谱法、气相色谱-质谱法、液相色谱法、液相色谱-质谱法和酶联免疫吸附法等。酶联免疫吸附法由于其抗原抗体的活性易受到温度、湿度和试剂盒批次的影响，重现性较差，只适用于大批量样品的筛选，不能用于定量；液相色谱法的灵敏度则达不到测定要求；气相色谱法和气相色谱-质谱法的样品前处理过程繁琐，耗时长，易出现回收率较低的问题；高效液相色谱-质谱法样品前处理过程简单，重现性好，灵敏度高，是测定氯霉素的首选方法。现在文献[7]的基础上，对样品前处理方法和色谱条件进行优化，利用超声提取和内标法定量。优化后的测定方法适用于刺参、大菱鲆、南美白对虾、三疣梭子蟹、鲤等水产品中氯霉素残留量的快速测定，该方法回收率和灵敏度均满足测定要求。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260 液相色谱仪、Agilent 6460A 三重四级杆质谱仪（均为安捷伦科技有限公司）；PL202-L电子精密天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］；SQP 电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；TG16-WS 台式高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；涡旋混合器（美国Talboys 公司）；超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；水浴氮吹仪（上海安谱实验科技股份有限公司）；超纯水器（上海摩勒科学仪器有限公司）。

乙酸乙酯、正己烷、甲醇（色谱纯，美国ACS）；氯霉素、氘代氯霉素标准品（德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司）；氢氧化铵（25%~28%，优级纯，西陇化工股份有限公司）；实验室用水均为超纯水。标准储备溶液浓度为100 mg/L，配制方法为准确称取（10.0±0.1）mg 氯霉素标准品，用甲醇溶解并定容至100 mL，-18 ℃保存。中间浓度标准溶液浓度为20 μg/L，配制方法为移取10 μL 标准储备液于50 mL 容量瓶中，用甲醇稀释定容至50 mL。

1.2 样品前处理

1.2.1 样品提取

大菱鲆、刺参、南美白对虾、三疣梭子蟹和鲤均取自日照当地养殖场。

分别称取经绞碎后的大菱鲆、刺参、南美白对虾、三疣梭子蟹、鲤样品5.00 g 于50 mL 聚丙烯离心管中，依次加入0.20 mL 浓度为100 μg/L 的内标溶液、0.45 mL 氢氧化铵和25 mL 乙酸乙酯，涡旋混合 30 s，超声提取 30 min，4 000 r/min 离心 5 min。移取5 mL 上清液于10 mL 离心管中，于45~55 ℃水浴中氮气吹干。

1.2.2 净化

向离心管中加入1 mL 甲醇水溶液［V（甲醇）∶V（水）=70∶30］溶解残留物，加入 2~3 mL 正己烷，涡旋1 min，6 000 r/min 离心 5 min，移去上层正己烷，取下层溶液过0.22 μm 滤膜，供液相色谱-串联质谱测定。

1.3 液相色谱及质谱条件

1.3.1 色谱条件

色谱柱为ZORBAX SB-C柱，规格为2.1 mm×50 mm，粒度 1.8 μm，流量 0.3 mL/min，柱温 35 ℃。进样量20 μL。流动相为甲醇水溶液[V（甲醇）∶V（水）=70∶30]。

1.3.2 质谱条件

离子化模式为ESI-，干燥气温度325 ℃，干燥气流量11 mL/min，雾化器压力45 310.26 kPa，毛细管电压4 000 V，增益电压Delta EMV（-）200 V，其他质谱参数见表1。

表1 多反应监测离子对及质谱参数

2 结果与分析

2.1 样品前处理优化

在样品中加入适量乙酸乙酯后进行超声提取，与文献[7]中采用匀质器匀质提取相比，该操作简单，可避免在处理批量样品时因刀头清洗不彻底导致的交叉污染。由于旋转蒸发仪一次只能浓缩一个样品，而氮吹仪可同时浓缩24 个样品，缩短了大批量样品前处理的时间，因此浓缩时采用水浴氮吹代替旋转蒸发。

2.2 色谱及质谱条件优化

采用ZORBAX SB-C色谱柱进行分离，对V（甲醇）∶V（水）进行优化，分别在比例为 90∶10，80∶20，70∶30，60∶40，50∶50 条件下测定，综合考虑氯霉素的响应值和峰型，选择的流动相比例为V（甲醇）∶V（水）=70∶30。

在ESI-模式下，先进行全扫描，确定目标化合物离子质量数，同时对毛细管出口电压进行优化；再采用子离子扫描，确定定性离子和定量离子，并对碰撞能量进行优化。在多反应监测（Multi reaction monitor, MRM）模式下，对目标化合物进行定性和定量分析。在优化的质谱条件下，空白大菱鲆样品中添加0.5 μg/kg氯霉素时，定量离子和内标化合物 MRM 图见图 1（a）（b）。

图1 空白大菱鲆样品中添加0.5 μg/kg 氯霉素时定量离子和内标化合物的MRM 图

2.3 线性范围及检出限

分别移取适量中间浓度标准溶液，配制成浓度为 0.1，0.5，1.0，2.5 和 5.0 μg/L 的溶液，在上述色谱和质谱条件下测定，以外标和内标的浓度比为横坐标，响应比为纵坐标绘制标准曲线，以3 倍信噪比（3 S/N）计算检出限。线性回归方程、相关系数和检出限见表2。结果显示，氯霉素在质量浓度0.1~5.0 μg/L 内呈现良好的线性关系，线性相关系数满足理化检测的要求（>0.99）。

表2 线性回归方程、相关系数和检出限

2.4 方法回收率和精密度

向未检出目标物的样品中分别添加0.1，0.2 和1.0 μg/kg 混合标准溶液，每个水平的添加量平行测定6 次，计算平均回收率和相对标准偏差（RSD），结果见表3，氯霉素回收率为92.0%~98.6%，RSD 为3.0%~5.1%，满足测定要求。

表3 方法回收率和精密度结果（n=6）

3 结论

对氯霉素残留量的测定标准方法进行了优化。水产品样品在碱性条件下，以乙酸乙酯为提取液，以超声提取代替匀质提取，浓缩时采用水浴氮吹代替旋转蒸发，提高了检测效率。同时采用高效液相色谱-串联质谱法测定，负离子多反应监测模式检测，内标法定量，确保了方法的回收率和准确度。本方法操作简单，灵敏度、回收率和精密度等方法学指标均能满足水产品中氯霉素的检测要求，适用于鲜活水产品中氯霉素残留量的批量测定。