柠檬汁纳米银抗菌复合膜的制备工艺优化及性能研究

马 璟，李蔚然，王丽杰，郝月薪，胡泳华，李 娟，陈巧玲,

（1.闽南师范大学生物科学与技术学院，福建漳州 363000；2.漳州城市职业学院食品工程系，福建漳州 363000）

果蔬采后在整理、清洗、运输、保藏等过程中，因机械伤、呼吸作用、酶、微生物等的影响，容易使果蔬腐败变质[1]。而果蔬在人们日常饮食结构中具有重要作用，因此如何提升果蔬采后品质并延长其保藏期，引起人们的关注。目前市售保鲜膜多以乙烯为母料，存在抑菌效果差、不易降解等诸多问题[2]。因此利用生物还原法制备抑菌性能良好且对环境友好的复合纳米包装材料成为研究人员的研究热点。

金属纳米粒子作为一种催化剂和抑菌剂具有非常好的活性[3]，其抑菌性能在近几年受到了国内外研究人员特别的关注[4-6]。其中纳米银因其光学、化学、生物等方面突出的性质成为制备抑菌材料的主要原料[7]。唐晓峰等[8]通过制备并分析纳米银无纺布的抑菌性能，发现纳米银粒子对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及芽孢杆菌的生长具有良好的抑制作用。研究表明纳米银粒子以聚合物形式存在时，具有更好的抑菌性和分散性[9]。这种方法解决了化学法合成的纳米银常出现团聚现象导致其抑菌效果被减弱的问题[10]。Wu 等[11]将纳米银与壳聚糖反应制备含柠檬汁固定化Ag 纳米颗粒的新型壳聚糖薄膜具有很好的抑菌保鲜效果。另有研究通过葡萄籽将硝酸银还原成纳米银粒子，制备了多功能纳米纤维素复合膜，该膜性能良好，具有较好的抑菌保鲜功能[12]。可见将硝酸银原位还原至保鲜膜中，可使纳米银的抑菌性能得到充分发挥，且分散性良好。

本研究以聚乙烯醇、甘油、可溶性淀粉的混合溶液作为膜基底，添加柠檬汁作为生物还原剂，硝酸银溶液为银来源，通过生物还原法将纳米银原位还原至保鲜膜中。其中柠檬原料易得，成本较低，其提取液富含还原性官能团，可作为纳米银的还原剂，同时可增强膜的抑菌抗氧化作用[13]。此保鲜膜有望在低纳米银浓度条件下，发挥良好抑菌效果。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

柠檬 福建省漳州市新华都超市；聚乙烯醇（PVA）合肥巴斯夫生物科技有限公司，AR；可溶性淀粉（SS）、甘油、硝酸银（AgNO3）国药集团化学试剂有限公司，AR；LB 培养基、技术琼脂粉 北京陆桥科技有限公司，生化试剂；大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、肠道沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌 广东微生物菌种保藏中心。

AR24CN 电子分析天平 上海奥豪斯仪器有限公司；DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器 上海立辰邦西仪器科技有限公司；DGG-9140B 电热恒温鼓风干燥箱 上海森信实验仪器有限公司；KQ5200DE 数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；SW-CJ-1FD 超净工作台 苏州江东精密仪器有限公司；LRM-250 生化培养箱 上海浦东荣丰科学仪器有限公司；UV-1100 紫外可见分光光度计 上海美普达仪器有限公司；CT3 质地分析仪 美国Brookfield 公司；JSM-6010LA 电子显微镜、JEM 2100F 透射电子显微镜 日本JEOL 公司；傅里叶变换红外光谱仪（ATR-FTIR）美国TA 公司；X 射线衍射仪 日本Rigaku 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 复合膜制备的单因素实验 取柠檬果肉榨取柠檬汁（LJ），4000 r·min-1下离心10 min，取上清液，测得pH 为2.83，放-20 ℃冰箱冷藏待用。准确称取PVA（2、3、4 g），加入蒸馏水，90 ℃水浴磁力搅拌至溶解为止（约30 min）。同时称取可溶性淀粉（1、2、3 g），在85 ℃下糊化，与PVA 溶液混匀，调节磁力搅拌器温度为85 ℃，再加入甘油（3、4、5 g）和5 mL 的硝酸银溶液（2、10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200 mmol/L），搅拌5 min 左右使均匀，待温度降至75 ℃，逐滴加入柠檬汁（3、5、7 mL），整个溶液体积为50 mL，10 min 后转至75 ℃超声处理30 min 后倒膜，75 ℃烘干1 h，揭膜，测试其抗拉伸强度（TS）、断裂伸长率（EAB）、水蒸气透过率（WVP）、吸湿性、透光率等物理性能，每组平行3 次实验。单因素固定条件为PVA 3 g，甘油3 g，可溶性淀粉1 g，柠檬汁7 mL，硝酸银浓度100 mmol/L。

1.2.2 正交试验 结合单因素实验结果，设计四因素三水平试验，确定制备复合膜的最优配方。正交试验因素及水平见表1，结果见表2。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and Levels table of orthogonal test

表2 正交试验结果Table 2 Results of the orthogonal tests

1.2.3 抑菌实验 采用打孔法测试抑菌膜的抑菌效果。将测试菌种活化并稀释至106～107CFU/mL。打孔后依次加入150 μL 的不同硝酸银浓度的（2、10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200 mmol/L）复合膜膜液，膜液同时含PVA 3 g、SS 0.5 g、甘油3 g、LJ 7 mL 等制膜材料，将等量聚乙烯醇-淀粉（PVASS）和聚乙烯醇-淀粉-柠檬汁（PVA-SS-LJ）空白样复合膜膜液作为阴性对照，根据单因素及正交试验确定空白膜的配方，在37 ℃生化培养箱内培养24 h，十字交叉法记录抑菌圈直径。

1.3 测试与表征

1.3.1 物理性能测试

1.3.1.1 抗拉伸强度（TS）和断裂伸长率（EAB）的测定 将待测膜裁剪成25 mm×4.10 mm 的条形，原始拉伸距离为20 mm，拉伸速度0.5 mm/s，初始拉力0.07 N，平行测量至少3 次，取平均值。

式中：TS 为膜的抗拉伸强度，MPa；F 为轴向拉伸力，N；L 为膜宽度，mm；X 为膜厚度，mm；EAB 为断裂伸长率，%；E 为膜样品在断裂时所达到的长度，mm；E0为膜初始长度，mm。

1.3.1.2 水蒸气透过系数（WVP）测试 采用中国标准GB/T 1037-1988 杯式法并略做修改。在玻璃杯中放入无水CaCl2。选择均匀、无孔、无褶皱的膜，用膜封口，并称重。游标卡尺测量其厚度。在相对湿度100%、温度为25 ℃底部为去离子水的干燥器中将称重后的玻璃杯放入，每隔一定时间取出玻璃杯称重，并算出WVP 数值。按下式计算：

式中：WVP 为水蒸气透过系数，g/0.01 h·m2；Δm 为稳定质量增量，g；A 为膜面积，m2；Δ t 为测定时间间隔，h；d 为膜厚度，mm；Δ p 为试样两侧的水蒸气压差，Pa。

1.3.1.3 吸湿性测试 将膜剪成大小为20 mm×20 mm的正方形，置于称量瓶中并放在干燥器内，于25 ℃、相对湿度100%条件下放置，待其质量恒定，测重量变化。

式中：吸湿性，%；M1为膜吸湿前的质量，g；M2为膜吸湿后的质量，g。

1.3.1.4 透光率测试 将待测样品剪成长方形，贴于比色皿表面，在波长400～800 nm 下测定吸光度，再将吸光度转换成透光率，以透光率大小表示膜透明程度，按下式计算膜的透光率（%）。

式中：A 为吸光度。

1.3.1.5 厚度测试 在膜上随机用游标卡尺测量5 个点，取平均值，读数时精确到0.00l mm。

1.3.2 结构表征测试分析

1.3.2.1 扫描电镜（SEM）分析 对复合膜样品的表面微观形貌进行扫描。加速电压为10 kV，工作距离10 mm，放大倍数1000 倍。

1.3.2.2 透射电镜（TEM）分析 扫描分析复合膜形貌和粒度分布。在测试膜样品之前，应将溶解在无水乙醇中的沉淀物用超声波分散，离心，转速5000 r/min，时间10 min，除去部分聚集的颗粒。再将溶解样品滴于铜网，于200 kV 电压下进行测试。

1.3.2.3 傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析 对复合膜官能团进行表征。扫描波数范围为400～4000 cm-1，分辨率4 cm-1，扫描次数64 次。

1.3.2.4 X 射线衍射（XRD）分析 对薄膜的晶体结构进行测试。膜样品烘干后研磨成粉末，测试范围为5°～80°，速度为4°/min。

1.4 数据处理

本实验通过SPSS 20.0 进行差异性数据分析，检验确定复合膜性能的显著性差异（P<0.05）。每组实验重复三次。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 PVA 含量对复合膜物理性能的影响 如图1A所示，复合膜的TS 随PVA 含量增大而减小，EAB呈现先下降后上升的趋势。PVA 作为分子间的一种填料，阻碍了复合膜间原有的螺旋结构，使TS 逐渐减小，与文献[14]相似。如图1B 所示，复合膜的WVP 随着PVA 加入量的增多而升高，而吸湿性呈现相反趋势。PVA 分子在复合膜内部均匀分散，因其具有良好的亲水性，故随着PVA 含量增加，复合膜WVP 升高。PVA 良好的分散性使复合膜的内部结构变得致密，所以吸湿性逐渐降低。如图1C 所示，3 g PVA 时透光率最高。适宜的PVA 添加量可增加复合膜的结晶性，与文献[15]相似。随着PVA含量的增加，膜的厚度逐渐增加。当PVA 含量为2、3、4 g 时，膜厚度平均值分别为0.09、0.09、0.11 mm。显著性分析可知，PVA 含量为2、3、4 g 时，TS 和EAB 之间没有显著性差异（P>0.05），而WVP 和吸湿性差异显著（P<0.05），且PVA 为2 g 时TS 和EAB值最高，WVP 值最低。综上，PVA 含量为2 g 时，TS 和EAB 最高，膜的伸长性和韧性较好，同时WVP 较低、吸湿性较好，水蒸气吸收和释放较为平衡，且膜厚度最薄，因此选用2 g 的PVA 含量制膜。

图1 PVA 含量对复合膜物理性能的影响Fig.1 Effect of PVA content on physical properties of composite membrane

2.1.2 甘油含量对复合膜物理性能的影响 如图2A所示，复合膜的TS 和EAB 均先升高后降低。甘油分子与SS 链上羟基形成新的氢键，其他更强的键的互作用力受阻，导致膜的TS 降低[16]。同时，随着甘油含量的增加，复合膜的结晶区遭到破坏，非结晶区域占比增加，复合膜的韧性得到加强，从而EAB 增加[16]。当甘油添加量超过4 g 时，复合膜的TS 和EAB 降低，与文献[17]相似。如图2B 所示，复合膜的WVP 和吸湿性随着甘油含量增加而增大。甘油含量增加，甘油分子中的羟基对SS 形成结晶的干扰作用增大，导致复合膜的结构出现松散倾向，水分子透过更容易[18]。此外，甘油含量增加，亲水性增加，因此复合膜的吸湿性增加，与文献[19]相似。如图2C所示，随着甘油含量的增加，透光率先下降后上升。甘油分子中带有亲水性羟基，其与SS 分子中的羟基形成新的氢键，同时淀粉的分子内氢键数量减少，使淀粉分子的部分结晶结构遭到破坏，复合膜的结晶度下降，故透光率上升[20]；这与文献[21]相似。随着甘油含量的增加，膜厚度先增加后减小。当甘油含量分别为3、4、5 g 时，膜厚度均值分别为0.11、0.14、0.12 mm。差异显著性结果显示，甘油含量为4 g 时，复合膜TS 差异不显著（P>0.05），但值最高；而其EAB 显著高于甘油添加量为3 和5 g组；其WVP 和吸湿性显著低于甘油含量为5 g 组（P<0.05），显著高于甘油含量为3 g 组（P<0.05），居于适中位置；透光率最低。综合多个因素，选择甘油含量4 g 制膜。

图2 甘油含量对复合膜物理性能的影响Fig.2 Effect of glycerin content on physical properties of composite membrane

2.1.3 SS 含量对复合膜物理性能的影响 如图3A所示，复合膜的TS 先上升后下降，而EAB 随着SS含量的增加而减小。SS 含量增加，提高了复合膜与PVA 大分子的相容性，使复合膜形成良好的内部结构，并具有良好的延展性[22]，故TS 增加；SS 超过合适的添加量后，复合膜内部结构被破坏，TS 减小。此外，随着SS 含量的增加，复合膜中的含水量降低，复合膜脆性增加，EAB 降低。如图3B 所示，随着SS 含量的增加，复合膜的WVP 先下降后上升，吸湿性先升高后降低。SS 含量影响复合膜结晶度，SS 含量增加，结晶度升高，复合膜形成紧密的网络结构，所以水分子不易透过[23]，WVP 降低。超过SS 适宜含量后，复合膜的结晶度遭到破坏，网格结构变疏松，所以WVP 又上升。如图3C 所示，三者的复合膜透光率均较高且差别不大，说明SS 含量对复合膜的透光率影响很小，这与李菲等[24]的报道相似。随着SS 含量的增加，膜的厚度先下降后上升。SS 含量分别为1、2、3 g 时，膜厚度均值分别为0.07、0.06、0.07 mm。差异显著分析，SS 添加量为1、2、3 g 时复合膜TS和EAB 值没有显著性差异（P>0.05）；而SS 添加量为1、2、3 g 时复合膜的WVP 与吸湿性适中，能达到水蒸气平衡；SS 添加量为1 g 时复合膜的透光率最好；因此综合选用1 g 的可溶性淀粉含量制膜。

图3 淀粉含量对复合膜物理性能的影响Fig.3 Effect of starch content on physical properties of composite film

2.1.4 LJ 含量对复合膜物理性能的影响 如图4A所示，复合膜的TS 无显著性差异（P>0.05），而EAB随着LJ 含量的增加而增加。LJ 的加入可形成共轭双键，使分子的稳定性增强，各基质间的相容性提高，所以复合膜的TS 和EAB 增加，与文献[25]相似。如图4B 所示，随着LJ 含量的增加，复合膜的WVP 和吸湿性先下降后上升。LJ 的加入在原有的溶液体系中引入了疏水基团，阻止水分的进入[26]。且SS 本身具有高吸水性，随着LJ 的加入，破坏了SS 间原有的不规则排列，同时SS 与LJ 的分子间作用力增强，使复合膜结构更加致密，造成较低的WVP 和吸湿性。但随着LJ 含量的进一步增加，膜结构致密性下降，WVP 和吸湿性又有上升的趋势。这与文献[27]相似。如图4C 所示，LJ 的加入能降低复合膜的透光率。在LJ 加入量为5 mL 时，致密的复合膜结构被破坏，所以透光率上升。随着LJ 含量的增加，膜的厚度总体差异变化不大，厚度均匀一致。当LJ 含量分别为3、5、7 mL 时，膜厚度均值分别为0.04、0.04、0.04 mm。差异显著性分析显示，当LJ 添加量为7 mL 时，复合膜TS 与其余两组无显著性差异（P>0.05）；其EAB 显著高于其余两组（P<0.05）；其WVP 与LJ 含量为3 mL 组相比没有显著性差异（P>0.05），但显著高于LJ 含量为5 mL 组（P<0.05）；其吸湿性居中，透光率也较好。因此综合选择7 mL的LJ 含量制膜。

图4 柠檬汁含量对复合膜物理性能的影响Fig.4 Effect of lemon juice content on physical properties of composite membrane

2.1.5 硝酸银浓度对复合膜物理性能的影响 如图5A 所示，硝酸银的加入能够提升复合膜的TS 和EAB。且在140 mmol/L 时TS 和EAB 均较好。纳米银颗粒均匀填充在PVA-SS-LJ 膜网络结构中，提高其稳定性。TS 和EAB 变小是因为部分纳米银颗粒发生了团聚现象，妨碍高分子链的自由移动，从而影响复合膜的力学性能，这与文献[28]相似。如图5B所示，硝酸银的加入使大多数复合膜的WVP 下降，同时，不同浓度下复合膜WVP 大多稳定在0.07～0.14 g/0.01 h·m2之间，吸湿性随硝酸银浓度的增加整体呈现下降趋势。因为PVA-SS-LJ 复合膜内部结构中聚合物链间的自由度较高，因此WVP 和吸湿性较高。硝酸银加入后限制聚合物之间的自由活动，故对WVP 和吸湿性造成阻碍[29]。如图5C 所示，硝酸银的加入能降低复合膜的透光率，纳米银溶液本身呈不透明褐色，颜色深度随浓度增加而增加，故导致透光率下降；与文献[28]相似。随着硝酸银浓度的增加，膜的厚度变化不大。当硝酸银浓度分别为2、10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200 mmol/L 时，膜厚度均值分别为0.07、0.07、0.09、0.06、0.06、0.07、0.07、0.06、0.06、0.07、0.07、0.06 mm。差异显著性分析显示，除硝酸银添加量为200 mmol/L 外，硝酸银添加量为140 mmol/L 时，膜的TS 和EAB 显著优于其他组（P<0.05），而WVP和吸湿性居中，透光率居中，因此综合选择硝酸银添加量为140 mmol/L。

图5 硝酸银浓度对复合膜物理性能的影响Fig.5 Effect of silver nitrate concentration on physical properties of composite membrane

2.2 正交试验结果

根据单因素实验结果，可知PVA、SS、甘油、LJ 含量以及硝酸银浓度均为影响复合膜综合性能的因素。得出纳米银复合膜的最优制备工艺。结果如表2 所示。

由表2 通过极差分析可知，影响复合膜TS 的主次关系为：A>B>D>C，此时最优组合为A3B1C3D2；影响复合膜EAB 的主次关系为：A>D>B>C，此时最优组合为A3B3C2D1；影响复合膜WVP 的主次关系为：A>C>B>D，此时最优组合为A1B1C2D1；影响复合膜吸湿性的主次关系为：B>A>D>C，此时最优组合为A1B1C1D3。优良的保鲜膜具有较好的力学性能，主要从TS 和EAB 两个指标来体现，WVP 和吸湿性以及透光率为次要考虑，根据各单因素主次顺序最优组合得本实验的优化组合为A3B1C2D1，即PVA含量3 g、SS 含量0.5 g、甘油含量为3 g、LJ 含量7 mL 以及硝酸银浓度130 mmol/L 时综合性能优良，TS、EAB、WVP、吸湿性、透光率分别为12.16 MPa、1111.59%、0.09 g/0.01 h·m2、12.56%、48.05%。

2.3 保鲜膜抑菌实验

抑菌实验结果如图6 所示，抑菌圈直径如表3所示。空白样品膜膜液（PVA-SS 和PVA-SS-LJ）对细菌没有抑菌性，而复合膜膜液各浓度对5 种细菌均有抑菌效果。其中大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌的抑菌圈明晰，抑菌效果最好。且根据抑菌圈直径可知，随着硝酸银浓度减小，抑菌圈直径变小，抑菌性能下降，但明显强于PVA-SS 和PVA-SSLJ 膜。其中，当硝酸银浓度为140 mmol/L 时，对五种细菌的抑菌性最强。这可能是因为纳米银与细菌菌种接触导致具有生物毒性的Ag+释放，在细菌内部Ag+与酶蛋白发生反应，使细菌的酶失活，进而导致细菌死亡[30]。

图6 复合膜对五种细菌的抑菌圈效果图Fig.6 Antibacterial circle diagram of the composite membrane against five kinds of bacteria

表3 复合膜对五种细菌的抑菌圈直径Table 3 Inhibition zone diameters of composite membrane on five kinds of bacteria

2.4 结构表征

2.4.1 保鲜膜成品图 从图7A～7C 膜成品图上可以看出，PVA-SS、PVA-SS-LJ 复合膜都较透明。PVASS-LJ-AgNPs 复合膜的颜色呈现深棕色，是由于生成了纳米银粒子形成了等离子效应[31]，深色可起到光保护作用[32]。

图7 PVA-SS、PVA-SS-LJ、PVA-SS-LJ-AgNPs复合膜的成品图Fig.7 Pictures of PVA-SS,PVA-SS-LJ,PVA-SS-LJ-AgNPs composite membrane

2.4.2 SEM 和TEM 分析 PVA-SS、PVA-SS-LJ 及PVA-SS-LJ-AgNPs 复合膜的SEM 图如图8A～8C所示，三种复合膜表面都较光滑，无褶皱。TEM 如图8D～8F 所示，纳米银颗粒粒径范围在20～100 nm之间。纳米银颗粒呈球形，且分布较为均匀。

图8 PVA-SS、PVA-SS-LJ 和PVA-SS-LJ-AgNPs 复合膜的SEM 图（A，B，C）和TEM 图（D，E，F）Fig.8 SEM（A,B,C）and TEM（D,E,F）images of PVA-SS,PVA-SS-LJ and PVA-SS-LJ-AgNPs

2.4.3 XRD 分析 PVA-SS、PVA-SS-LJ 及PVASS-LJ-AgNPs 复合膜的XRD 谱图如图9A 所示，在添加AgNPs 前后，PVA-SS 和PVA-SS-LJ 膜的结构都未发生明显变化。通过图9A 谱图可知在2θ=38.22°、44.12°、64.67°和77.55°处出现银的衍射峰，分别对应银晶体的（111）、（200）、（220）和（311）晶面，说明复合膜中成功引入纳米银粒子，产生的纳米银晶型与杨维佳等[33]报道相似。

2.4.4 FIIR 分析 PVA-SS、PVA-SS-LJ 及PVASS-LJ-AgNPs 复合膜的红外吸收光谱如图9B 所示，由图可知添加AgNPs 后，在1714.48 和1537.54 cm-1出现C=O 和-NO2键的特征伸缩振动峰，表明PVA-SSLJ-AgNPs 复合膜中产生了新的化学键。1419.89 cm-1处是CH-OH 的伸缩振动峰[34]，PVA-SS-LJ-AgNPs与两空白复合膜相比无此峰。这是柠檬汁原位还原硝酸银生成纳米银粒子所致[13,35]。

图9 PVA-SS、PVA-SS-LJ 和PVA-SS-LJ-AgNPs 复合膜的X 射线谱图及红外谱图Fig.9 X-ray and infrared spectra of PVA-SS,PVA-SS-LJ and PVA-SS-LJ-AgNPs composite films

3 结论

本文采用常规PVA、SS、甘油保鲜膜的制备工艺，以LJ 为还原剂将AgNPs 原位还原至保鲜膜中。本文通过单因素以及正交试验，得出PVA-SSLJ-AgNPs 保鲜膜的最优配方为PVA 3 g、甘油3 g、SS 0.5 g、LJ 7 mL，硝酸银130 mmol/L，其TS、EAB、WVP、吸湿性、透光率等指标值为12.16 MPa、1111.59%、0.09 g/0.01 h·m2、12.56%、48.05%，抑菌圈直径为15.01 mm。研究发现，LJ 的加入能明显提高复合保鲜膜的EAB 值，适当平衡复合保鲜膜的WVP 和吸湿性。PVA-SS-LJ-AgNPs 保鲜膜从样品照片可见表面光滑，颜色成棕色，经SEM 分析也证实保鲜膜表面光滑，质地均匀，而在TEM 下可见纳米银粒径分布均匀，分散性好。XRD 显示纳米银（111）、（200）、（220）和（311）晶型的存在，证明了纳米银粒子的成功引入。因此，该法成功制备的物理以及抗菌性能良好的纳米银抗菌膜，为功能性保鲜膜的研究提供了新思路。