冷冻脱脂HPLC测定食用植物油中4种多环芳烃

潘晓玉，赵逸涵，王宗义，刘方征，高婧怡，赵修平，王雨萱，何世慧

(北京农学院 食品科学与工程学院/食品质量与安全北京实验室/农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室，北京 102206 )

PAHs的检测主要有高效液相色谱法(HPLC)[4-5]、气相色谱-质谱法(GC-MS)[6-7]、液相色谱-串联质谱法[8]和气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)[9]等。其中HPLC、GC-MS较为普及，GC-MS/MS的选择性则更优。但无论何种检测方法，就食用植物油而言，脱除油脂的干扰都是检测PAHs的关键。固相萃取柱[10]、分子印迹色谱柱[11]和凝胶渗透色谱[12]等技术，都有较好的除脂效果，但成本相对高或依赖专用设备。冷冻除脂是一种成本低、操作简单的方法[13]，对简化食用植物油样品处理，是较为实用的方法之一。该研究通过优化冷冻除脂方法，结合HPLC分离和荧光检测器(FLD)的高灵敏性，建立了食用植物油中PAH4的检测新方法。

1 材料与方法

1.1 试验仪器和材料

LC-20AD 液相色谱仪、RF-10AXL 荧光检测器(日本岛津公司)；PAH专用色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，美国 Waters 公司)；5810R高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；BCD-272WDGD 冰箱(中国海尔公司)；RE-2000A 旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)、BF-2000氮气吹干仪(北京八方世纪科技有限公司)；MS 3 basic 涡旋混匀器(德国IKA公司)；0.22 μm尼龙微孔滤膜(天津博纳艾杰尔科技有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 样品前处理 取0.5 g (精确至 0.01 g)食用油样品于50 mL离心管中，加入16 mL乙腈-水(15∶1)，2 000 r/min涡旋5 min，4 000 r/min 离心5 min，于冰箱中冷冻(-20 ℃)2 h，使下部油脂层凝固，迅速将乙腈提取液倾倒至鸡心瓶中，下层油脂重复以上步骤，再次提取1次，合并提取液至鸡心瓶中，40 ℃旋蒸至干，加入1 mL乙腈涡旋复溶，吸取复溶后溶液过0.22 μm滤膜于进样瓶中，待测。

1.2.2 标准溶液的配制 将2 000 mg/L多环芳烃标准混合溶液用二氯甲烷稀释，得到200 mg/L的混合标准储备溶液；混合标准储备液用乙腈稀释获得1 mg/L的多环芳烃中间工作溶液，于棕色贮液瓶中-20 ℃贮藏(用前放置到室温)。用乙腈稀释中间工作溶液，得到1、5、10、20、50和100 μg/L的标准工作溶液，用于标准曲线绘制。

1.2.3 仪器分析条件 色谱柱：Waters PAH C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：超纯水(A)-乙腈(B)；流速1 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：20 μL。梯度洗脱程序：0.01～5.00 min: A保持50%，B保持50%; 5.00～20.00 min: A从50%下降到0%，B从50%上升到100%；20.00～28.00 min:A保持0%，B保持100%；28～32 min:A从0%上升到50%，B从100%下降到50%；32～36 min:A保持50%，B保持50%。荧光检测参数：BaA的保留时间为22.079 min，激发波长为270 nm，发射波长为385 nm；CHr的保留时间为22.799 min，激发波长为270 nm，发射波长为385 nm；BbF的保留时间为24.417 min，激发波长为256 nm，发射波长为446 nm；BaP的保留时间为26.279 min，激发波长为292 nm，发射波长为410 nm。

1.2.4 方法学考察 按1.2.1的样品处理方法大豆油进行样品处理，上机检测观测目标物色谱峰的干扰情况，对选择性进行评价；通过校正曲线方程的R2值，评价方法的线性；样品基质中，以目标物色谱峰3倍信噪比和10倍信噪比分别计算方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ)；参照样品中目标物的实际浓度进行3水平6重复的加标回收率试验，计算回收率和相对标准偏差，对准确度和精密度进行评价，其中最低加标水平大于目标物实际含量水平的二分之一。

2 结果与分析

2.1 冷冻除脂条件的优化

食用植物油经乙腈提取后，部分油脂会溶解在乙腈中，干扰色谱分离的检测，需要进行脱除。研究表明，食用油加乙腈涡旋、离心后，经超低温冷冻使油脂固化，并立即转移提取液，可有效去除其中的油脂，且当提取液乙腈中加入少量水的条件下(乙腈水的体积比为15∶1)，效果更佳[14]。本试验使用普通冰箱，延长冷冻时间至2 h，可以使脂肪全部冻住，从而转移全部的乙腈提取液，且试验结果表明，经本试验的冷冻脱脂处理，可用于HPLC测定。由于本试验使用的是荧光检测器，稳定同位素内标不能发挥作用，因此，提取冷冻2次，合并提取液进行处理，从而达到提高提取效率的目的。

2.2 方法学考察

由典型色谱图(图1)可见，采用PAH专用色谱柱，PAH4在大豆油样品基质中获得有效分离，图1为食用大豆油样品未曾加标及其加标10 μg/kg PAH4后的色谱图，根据图1，表明该方法选择性良好，可以实现4种物质的分离。

A.大豆油原样 B.加PAH4 10 μg/kg；1:BaA；2:CHr；3:BbF；4:BaP图1 PAH4分离的高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of PAH4

通过对系列标准溶液进样分析，得到校正曲线方程见表 1，在1～100 μg/L的考察范围内，PAH4线性良好，R2>0.999 7。由于样品中4种目标物的本底值很高，空白样不易获得，不能采用空白加标的方法评价LOD、LOQ，因此采用实际样品中分别以3倍信噪比和10倍信噪比计算方法的评估LOD和LOQ，亦列于表 1, PAH4的LOD和LOQ分别为0.06～0.32 μg/kg和0.19～1.07 μg/kg，远低于食用油中PAH4的关注浓度。

表1 方法学验证Tab.1 Methodological validation

2.3 回收率与精密度

由于常见食用植物油的样品基质较为相近，本试验以大豆油为代表进行3水平加标回收试验，每个水平做6个重复，计算方法回收率和相对标准偏差(RSD)。由于食用油样品中PAH4有较高的本底，定量限水平的加标浓度不能获得，故设最低加标质量浓度为10 μg/kg。试验结果见表 2，总体日内回收率为77.09%～96.00%，RSD为3.65%～11.75%。回收率满足GB/T 27417—2017[15]要求，当浓度水平范围为小于0.1 mg/kg时，回收率范围为60%～120%。

应用本方法检测市售稻米油、玉米油、花生油、大豆油，每种类型各取2个不同厂家，每家样品重复测量2次，检测结果列于表 3。结果显示，BaP含量在1.00～3.20 μg/kg，PAH4为1.92～20.58 μg/kg。

表3 食用油中PAH4的检测结果Tab.3 Determination results of PAH4 in edible plant oils

3 讨 论

该研究建立了冷冻脱脂-高效液相色谱法测定食用植物油中PAH4的新方法。该方法具有样品处理相对简单、成本低的特点，减少了对专用设备的依赖，满足一般试验室检测的需要，具有普遍适用性；冷冻脱脂尽管脱脂不是十分彻底，但能够满足HPLC分析的需要，通过使用并定期更换色谱分离预柱方法，能够有效避免样品对色谱柱的污染，从而实现对检测方法的简化；该方法检出限、准确度均能够满足食用油中PAH4监测的需要。实际样品检测显示，中国食用植物油中PAH4污染有一定食品安全风险，值得持续关注。