CoCl2诱导低氧对奶牛胎盘滋养层细胞活性的作用

张真豪，袁梦仪，付博凡，高玉平，肖龙菲，倪和民，郭凯军，苏 月，安 红，王相国*

(1.北京农学院 动物科学技术学院，北京 102206；2. 北京市昌平区动物疫病预防控制中心，北京 102206；3.天津市蓟州区下仓镇人民政府，天津 301905)

在不同生物体和组织器官中，低氧应答结果对机体的影响具有两面性[1]。由于妊娠初期滋养层细胞浸润程度浅，胚胎与母体之间物质交流建立不完整，螺旋动脉尚未重塑，胎盘滋养层细胞未完成转化而形成完整的血管系统，使该阶段胎盘组织处于相对低氧环境中[2-4]。

以往关于低氧对人和小鼠的胎盘滋养层细胞影响的研究表明，滋养层细胞功能受PLGF调节。PLGF作为血管内皮生长因子之一，能促进血管生成并调节内皮细胞增殖[5]，但其对滋养层细胞的调控作用受滋养层细胞局部微环境影响[6]。PLGF缺失或抑制虽然能减少新血管产生，但不影响血管的发育[7]。体外试验发现，PLGF通过作用于微血管内皮细胞与脐静脉内皮细胞，促进其迁移与增殖[8]。研究证实，PLGF能使内皮细胞中DNA合成显著上升，诱导内皮细胞激活[9]。在早孕期，胎盘绒毛内合体滋养细胞中的PLGFmRNA表达较强，但在孕晚期胎盘血管合体膜中的PLGFmRNA表达最丰富[7]。为了调节内皮细胞功能、增强胎盘血氧供给，滋养层细胞合成大量PLGF[10,11]。目前，低氧对人类胎盘滋养层细胞生长发育的影响已有相关报道，但关于低氧对奶牛胎盘滋养层细胞影响还少见报道。就此系统研究了低氧状态对奶牛胎盘滋养层细胞造成的一系列影响，旨在为奶牛胎盘发育研究提供试验依据。

1 试验材料与方法

1.1 试剂与仪器

试验动物细胞：奶牛胎盘滋养层细胞系(hTERT-BTC)由北京农学院动物科学技术学院动物育种与辅助生殖团队前期构建[12]并保存。

胎牛血清：杭州四季青公司。逆转录试剂盒cDNA KIT、荧光定量试剂盒SYBR均为日本Toyobo公司。BCA蛋白定量检测试剂盒：北京Leagene公司。DMEM/F12培养基：美国Hyclone公司。兔抗人hTERT单克隆抗体和兔抗人E-Cahderin单克隆抗体为美国Abcam公司。转染试剂Lipofectamine2000为美国Invitrogen公司。引物合成：上海生工公司。CO2恒温培养箱314819-1280美国Thermo公司，荧光定量PCR仪G8830A美国ABI公司，凝胶成像仪721BR09549美国AlphaInotech公司，B2型生物安全柜BCM-1300A苏州安泰空气技术有限公司，高速台式低温离心机ALLEGRA-64R德国Eppendorf公司。

1.2 建立CoCl2诱导的细胞低氧模型

将奶牛胎盘滋养层细胞接种于24孔板，培养至细胞密度达到70%～80%，加入0、50、100、150、200、250 μg/mL的CoCl2筛选培养基，培养基每3 d更换1次，观察细胞生长状态，重复3次。利用Western Blot检测缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达情况。

1.2.1 实时荧光定量PCR检测PLGFmRNA表达量 利用Trizol法提取常氧组(0 μg/mL CoCl2)、低氧组(200 μg/mL CoCl2)胎盘滋养层细胞系中RNA，每组3个重复，反转录cDNA。以cDNA为模板，交由上海生工设计引物。表1是引物序列。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

PCR扩增体系为：10×buffer 2.5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)2.0 μL，MgCl21.5 μL，TapDNA聚合酶0.25 μL，上游引物1.0 μL，下游引物1.0 μL，ddH2O 14.75 μL，cDNA 1 μL；反应程序为：95 ℃预变性5 min，按95 ℃下反应30 s、56 ℃下反应30 s、72 ℃下反应60 s循环反应30次，最后72 ℃延伸10 min。

1.2.2 显微镜观察 胎盘滋养层细胞铺满六孔板后，设置常氧组(0 μg/mL CoCl2)、低氧组(200 μg/mL CoCl2)各3个孔，均处理24 h后，用10 μL枪头按照标记线做划痕，每个孔3条划痕，用PBS冲洗，4%多聚甲醛孵育固定10 min，固定后用PBS清洗2次，用结晶紫染色液染色10 min，用PBS缓冲液清洗残留染色液，置于显微镜下观察，随机选取6个镜下视野，拍照。每组试验重复3次。

按3∶1的比例将Matrigel基底胶(培养基与枪头用4 ℃预冷处理)与不含血清的DMEM/F12培养基进行稀释处理，在Transwell小室滤膜中按50 μL/孔的剂量加入Matrigel基底胶，在37 ℃培养箱中恒温孵育30 min，收集2×104个经200 μg/mL CoCl2处理24 h的奶牛胎盘滋养层细胞，将Transwell上室用Matrigel包被，加入200 μL无血清DMEM/F12培养基重悬后的细胞，在下室中加入500 μL的DMEM/F12完全培养基(含10%胎牛血清)，放入含有5% CO2的37 ℃恒温培养箱中培养24 h；取出Transwell小室，将滤膜上方的上室内的细胞和基质胶用棉签轻轻擦去，再用PBS缓冲液冲洗干净，用4%多聚甲醛将小室包裹孵育，固定穿过滤膜的细胞10 min，用PBS缓冲液清洗2次，用结晶紫染色液染色10 min，再用PBS缓冲液清洗残留染色液，干燥后将小室滤膜下室面朝上，置于显微镜下观察，镜下随机选取6个视野，拍照。每组试验重复3次。

1.2.3 Western Blot检测 将低氧处理细胞和未处理细胞(作为阳性对照)中的总蛋白分别提取出来。采用BCA法测定样品蛋白质浓度。制备SDS-PAGE胶(由12%分离胶和5%浓缩胶组成)，将胶板放入电泳槽内，浸泡于电泳液中；在点样孔内加入蛋白Marker与蛋白样品，接通电源并设置80 V电压电泳20 min后转为100 V电压继续电泳45 min；观察蛋白Marker达到分离要求后，将胶板取出浸泡于转膜液中，在转膜液中切下大小合适含有目的条带的胶条并按照正极板、海绵垫、滤纸、PVDF膜、胶、滤纸、海绵垫和负极板的顺序放置转膜夹，在电泳槽内加入预冷好的转膜液与冰盒，放入转膜夹，将电泳槽放入盛有冰块的盆中，100 V电压转膜75 min；转膜结束之后，室温下将转好的PVDF膜放入5%脱脂奶粉内，于摇床上缓慢摇动封闭1～2 h；用5%脱脂奶粉配制E-Cadherin抗体(一抗)，将封闭结束后的PVDF膜放入一抗内并放在4 ℃冰箱内孵育，过夜；一抗孵育结束后用含0.1% Tween20的PBS缓冲液洗涤5次，每次15 min；然后将PVDF膜放入HRP标记的二抗中于摇床上室温孵育1～2 h；二抗孵育完毕后，将PVDF膜用PBST缓冲液洗涤5次，即可滴加ECL化学发光剂混合液，进行暗室X-射线胶片显影。

采用SPSS 18.0分析软件对数据进行显著性检验，采用t检验方法对相关数据进行统计学处理。P<0.05视为显著性差异。

2 结果与分析

2.1 最适CoCl2浓度

HIF-1α是细胞在低氧条件下出现的低氧应答蛋白，其含量会随氧分压变化而变化，以此作为筛选依据。图1 显示，不同浓度的CoCl2诱导表达的HIF-1α量不同，呈现出随着CoCl2浓度的升高而显著升高的趋势(P<0.05)。因此，以CoCl2浓度为200 μg/mL作为后续建立模型的浓度。

M:蛋白Marker; 1～5: 0、100、150、200、250 μg/mL CoCl2M: Protein Marker; 1-5: 0, 100, 150, 200, 250 μg/mL CoCl2图1 不同CoCl2浓度下HIF-1α的表达情况Fig.1 The expression of HIF-1α under different concentrations of CoCl2

2.2 低氧对胎盘滋养层细胞形态、迁移及浸润的影响

图2显示，常氧环境下的胎盘滋养层细胞分布均匀且密集，细胞形态正常，细胞分裂能力较强，生长状态良好，能够清楚地观察到细胞伪足及合胞体。低氧环境下的滋养层细胞密度下降，数量明显减少，滋养层细胞增殖缓慢，伪足数量减少，同时合胞体数量减少，细胞形态出现不同的改变。

图2 低氧条件下滋养层细胞形态、迁移及浸润变化情况Fig.2 Changes in trophoblast morphology, migration and infiltration of trophoblast cells under hypoxia

常氧状态下的滋养层细胞在迁移过程中分布均匀，迁移细胞状态良好；但在低氧环境下的胎盘滋养层细胞表现出明显的迁移减缓，迁移率下降，分布不均匀并且有明显的空白区域。

常氧状态下的滋养层细胞浸润能力强，细胞数量多，密度大，细胞形态饱满，状态良好。低氧环境下的胎盘滋养层细胞在Transwell小室中穿梭数量减少，表现出明显的浸润率下降。

2.3 低氧条件下PLGF mRNA表达

胎盘生长因子(PLGF)作为胎盘生长发育主要的影响因子，在胎盘滋养层细胞增殖分化过程中起着重要作用，并对细胞生理功能具有显著影响。图3结果显示，常氧条件与低氧条件下PLGFmRNA的表达量无显著差异(P>0.05)，说明PLGFmRNA的表达不受氧分压变化的影响。

图3 常氧与低氧条件下 hTERT-BTC中PLGF mRNA的表达情况Fig.3 Expression of PLGF mRNA in hTERT-BTC under normoxia and hypoxia conditions

2.4 低氧条件下E-Cadherin表达

图4显示，E-Cadherin的表达量在低氧环境下表现出显著下降趋势(P<0.05)，说明低氧环境会使E-Cadherin表达量减少。

图4 常氧与低氧条件下hTERT-BTC中E-Cadherin的表达情况Fig.4 Expression of E-Cadherin in hTERT-BTC under normoxia and hypoxia conditions

3 讨 论

氧气是细胞生长发育的必要条件之一，是细胞的必要营养素。氧气含量过高或过低都会引起机体的适应性反应，有研究表明子宫内氧浓度能够调节并影响胎盘的结构和功能[13]。在人类胎盘的研究过程中，人们对缺氧的作用有着不同的见解[14]。HIF-1α是细胞内表达的低氧标志物，本研究通过Western Blot检测HIF-1α在胞内的表达变化来筛选CoCl2浓度，并以此建立细胞体外低氧模型。有研究比较了两种常用的低氧模型诱导剂CoCl2与DMOG，结果显示，200 μM CoCl2可明显引起HIF-1α的靶基因Glut1的表达增加，但对Vegfα无明显影响；500 μM的DMOG则对Glut1和Vegfα均有明显影响[15]。说明CoCl2与DMOG均可用于建立体外低氧模型，但诱导低氧的作用机制或产生程度有所不同，从而使下游基因表达情况也出现不同趋势。

有研究表明，低氧可以促进人胎盘滋养层细胞增殖和迁移[16]。而对于反刍动物，我们的试验结果显示，低氧环境下的胎盘滋养层细胞增殖缓慢，密度下降。这种结果的差异可能与试验对象的种族或发育状态有关[17]。胎盘滋养层细胞由于其特殊性，本身具有迁移、侵袭功能，在胚胎着床后完成与子宫内膜上皮细胞的接触与融合，并进一步迁移、浸润完成胎盘血管系统的建立[2]。本研究的结果显示，在低氧环境中，细胞出现明显的迁移减缓、迁移率下降、浸润率降低等滋养层细胞功能衰退的现象。研究表明，胎盘滋养层细胞侵袭、分化的能力受损可能与不明原因的自然流产有关[18]。

胎盘生长因子(PLGF)作为影响胎盘生长发育的主要因子，对胎盘滋养层细胞的生长发育具有重要作用，其通过自分泌或(和)旁分泌方式对自身及周围细胞均有不同程度的作用[19]。Fumihito Nishimoto等[20]通过CoCl2诱导获得低氧环境，对来自于人胎盘分离出的原代滋养层细胞进行实时PCR扩增和ELISA试验，发现在低氧环境下PLGFmRNA的表达水平显著降低，但是HIF-1α不改变PLGFmRNA的表达。对于以奶牛为代表的反刍动物，试验结果显示，PLGFmRNA的表达不受氧分压变化的影响，推测低氧环境下，各因子对其的影响主要作用于蛋白质翻译过程，这为后续研究提供了新的方向。

E-Cadherin是上皮细胞表达的特殊表面黏附分子，可作为上皮细胞形态特征的重要参考因子，胎盘滋养层细胞作为上皮样细胞，E-Cadherin在其发育转化过程中具有重要意义，尤其表现在涉及胎盘血管生成的生理过程。有研究结果表明，低氧通过HIF-1α诱导Snail上调，从而导致E-Cadherin表达量下降[21]，本研究结果与此相吻合。低氧环境导致的E-Cadherin蛋白表达减少可能与细胞形态变化、伪足减少等有关。

总之，本研究利用CoCl2成功构建了奶牛胎盘滋养层细胞低氧模型，利用该模型系统的研究了低氧状态对于奶牛胎盘滋养层细胞造成的一系列影响，为探究奶牛胎盘早期发育奠定理论基础。